1. 研究目的与意义
内容：
1.选取9种单萜氧类促渗剂，通过Franz扩散池法，以大鼠皮为屏障，以布洛芬、水杨酸和5氟尿嘧啶为模型药物，评价单萜氧类促渗剂离体促渗效果；
2.通过细胞电阻仪测定9种单萜氧类促渗剂作用下，离体大鼠皮肤电阻，并通过数据分析，拟合单萜氧类促渗剂对药物促渗效果与对皮肤电阻影响的关联性；
2. 文献综述
单萜氧类促渗剂的促渗规律研究
摘 要：近年来，萜烯类经皮渗透促进剂具有毒性低,促透能力强,可改善皮肤通透性,对亲水、亲脂药物均有促渗作用,具有低浓度高促透性的特点，在透皮给药系统中日益发挥着重要作用,显示出良好的应用前景。现对其来源、分类、促透机制、影响渗透效果增强的因素、实际应用、选择评价及应用前景进行综述。经研究发现，最受欢迎的做法是促渗剂的应用，我们选择具良好经皮促透效果的单萜氧类化合物，即α-松油醇，芳樟醇，桉叶油醇，香叶醇，丁香醇，4-萜品醇，薄荷脑，樟脑等进行综述。在本文中我们主要研究单萜氧类化合物作为促渗剂对于经皮给药系统的研究。
关键词：单萜氧类化合物；透皮给药系统；促渗作用；安全性
1.介绍
1989年Williams等[1]发现植物挥发油具有经皮渗透促进作用，其后使用植物挥发油(essentialoils)作为促渗剂的研究日益引起人们的重视。挥发油中的主要成分是萜烯类化合物(terpenes)，萜烯类化合物指具(C5H8)n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，为很多祛风通窍中药的成分，具有化痰止咳、驱风发汗、驱虫镇痛等生理活性，尤以单萜(monoterpene)和倍半萜(sesquiter-pene)及其氧化物多见。
单萜氧类化合物主要从天然植物中提取，具有促透效果强、毒性低、对皮肤刺激性小[1]等优点。目前促透作用明确的单萜氧类化合物主要有：茴香脑、龙脑、樟脑、香芹酚、香芹酮、1,8-桉树脑(桉油精)、1,4-桉树脑、丁香油酚、香叶醇、柠檬油精、薄荷醇等，它们的结构中有极性官能团，适于在角质层脂质片层排列，促透作用强，支链少的作用则更强[2]。表1列举了部分单萜氧类的性质及其结构：文献指证了萜烯类物质的沸点越低，促透效果越好[26]。其中薄荷酮(bp210℃)、薄荷醇 (bp215℃)和松油醇( bp217℃)等沸点均较低，促透作用亦较突出。
表1.萜烯类促渗剂
萜烯 | 类型 | 化学式 | 分子量 | logP | 沸点(℃） | 化学结构 | Ref. |
茴香脑 | 单萜 | C10H12O | 148.202 | 3.17 | 237.5 | [3] [4] [5] | |
龙脑 | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 2.71 | 212 | [3] [6] [7] | |
樟脑 | 单萜 | C10H16O | 152.233 | 2.13 | 207.4 | [6] [8] | |
香芹酚 | 单萜 | C10H14O | 150.22 | 3.28 | 237.7 | [9] | |
香芹酮 | 单萜 | C10H14O | 150.218 | 2.265 | 230.5 | [10] [11] | |
1,8-桉树脑 (桉油精) | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 2.82 | 174 | [12] [3] [9] [10] [11] [14] [15] [16] [17] [18] | |
1,4-桉树脑 | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 2.58 | 173.5 | [3] [17] [18] | |
丁香油酚 | 单萜 | C10H12O2 | 164.201 | 2.2 | 255 | [4] | |
葑酮 | 单萜 | C10H16O | 152.23 | 2.13 | 193.5 | [11] | |
香叶醇 | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 3.28 | 229.5 | [3] [11] | |
柠檬油精 | 单萜 | C10H16 | 136.234 | 4.45 | 175.4 | [12] [3] [10] [11] [14] [16] [19] | |
芳樟醇 | 单萜 | C10H18O | 154.25 | 3.28 | 198.5 | [15] | |
薄荷醇 | 单萜 | C10H20O | 156.265 | 3.2 | 215.4 | [12] [20] [3] [9] [10] [15] [21] [22] | |
薄荷酮 | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 2.63 | 205 | [4] [9] [15] [21] [22] | |
胡薄荷酮 | 单萜 | C10H16O | 152.233 | 2.56 | 224 | [22] | |
藏花醛 | 单萜 | C10H14O | 150.218 | 2.9 | 217.3 | [17] [18] | |
松油烯-4-醇 (4-萜品烯醇) | 单萜 | C10H18O | 154.249 | 2.99 | 209 | [11] [14] | |
α-萜品烯醇 | 单萜 | C10H18O | 154.25 | 2.79 | 217.5 | [11] | |
四氢化香叶醇 | 单萜 | C10H22O | 158.281 | 3.64 | 212.5 | [3] | |
百里酚 | 单萜 | C10H14O | 150.22 | 3.28 | 233 | [9] [11] | |
马鞭草烯酮 | 单萜 | C10H14O | 150.22 | 1.97 | 227.5 | [11] |
2.促渗效果
化学促透法是指在外用制剂处方中加入经皮促渗剂来降低皮肤的屏障功能从而促进药物有效成分透皮吸收的方法。因此，研究开发安全有效的促渗剂是经皮用药的热点领域。目前，文献报道单萜氧类化合物作为促渗剂有较好的促透性能，安全性能高，作用迅速，促渗活性及时间可预测且具良好的重复性。
2.1薄荷脑
薄荷脑是薄荷挥发油的主要成分，其左旋体又称薄荷脑，对皮肤和黏膜有清凉和弱麻醉作用，可用于镇痛、止痒、防腐和杀菌。研究发现，薄荷脑对多种药物的经皮渗透具有显促进作用。李娟等[13]选择非诺洛芬钙作为模型药物，研究并比较薄荷脑，桉叶油醇，a-松油醇及常用的氮酮和油酸的经皮促透效果，研究结果显示，所选择的三种单萜氧类化合物的促渗效果均好于常用的化学促渗剂氮酮（桉叶油醇＞薄荷脑＞a-松油醇＞氮酮＞油酸），结果显示：单萜氧类促渗剂的促透性能良好。孙囯庆等[23]选择青蒿琥酯为模型药物，采用体外透皮试验研究了薄荷脑，桉叶油醇等促渗剂和常用的化学促渗剂的经皮促渗效果，结果显示了所选择的促渗剂中，薄荷脑表现出了最强的促渗效果，且促渗效果好于常用的化学促渗剂氮酮。
2.2桉叶油醇
李中东等[24]选择丙酸氯倍他索作为体外透皮试验的模型药物，研究桉叶油醇的体外经皮促渗效果，实验结果显示，1.0%-5.0%桉叶油醇均表现显著的经皮作用且呈剂量依赖性关系。翁伟宇等[25]研究桉叶油醇对川芎嗪的经皮促渗效果，2%桉叶油醇的促透性能良好，且优于同浓度的氮酮。
2.3丁香酚
文献报道研究显示，丁香油对阿魏酸，5-氟尿嘧啶等药物表现出了良好的经皮促渗效果。沈琦等[27]利用体外透皮试验测定了丁香酚对5-氟尿嘧啶的体外经皮促渗效果，结果显示丁香油的经皮增透倍数可达到110倍。高春华等[28]采用体外透皮试验测定了不同浓度丁香酚的经皮促渗活性，实验结果显示，不同浓度的丁香酚可在不同程度上促进阿魏酸的经皮吸收，其中，2%丁香酚作用最强。
近年来研究发现，单萜氧类促渗剂经皮促渗效果表现出了良好的性能，甚至优于化学促渗剂氮酮。单萜氧类作为促渗剂的应用前景广，开发性高。
3.促透机制现在认为萜烯类化合物的促透机制主要是[26]：①直接作用于SC,破坏脂质双分子层结构,增加其流动性;通过提取脂质从而打开角质层的极性孔道；②降低 S C细胞间桥粒粘聚性,使角蛋白结构疏松,增加药物在SC中的扩散；③影响药物理化特性如溶解度、分配系数,提高药物在SC的热力学活性和扩散系数等,提高其渗透性能。
Cornwell[14]采用DSC和小角X-射线衍射法研究了1,8-桉树脑和橙花叔醇对人SC的影响。SC在72℃,83℃有2个脂质相转变峰,1,8-桉树脑使相变温度降低20℃,降低熵变32%,但前一个峰的热焓降低,后1个峰的热焓无变化；橙花叔醇也使熵变降低，表明两者均能改变SC的脂质结构。Krishnaiah[20-21]等发现柠檬烯和香芹酮均使上述特征峰强度减弱、峰高下降,且具浓度依赖性,峰位无蓝移,认为萜烯类物质对 S C脂质有提取作用。Narisetty[4]和Jain[22]等在对一系列萜烯类促渗剂进行FT-IR分析后发现，未经处理的皮肤因脂质间氢键在1650cm-1处有1裂解峰，处理后的皮肤该峰合并为单一峰,推测为萜烯类物质破坏了脂质氢键网络所致。DSC和ESR法可进一步证明PE对皮肤的作用部位[4, 20-22]。DSC研究证明，正常皮肤经水或乙醇-水处理后脂质的相变温度分别为58.6、70.6、86.2℃，经萜烯类物质处理后，相变温度改变且吸热峰变宽。ESR研究揭示，经萜烯类物质处理的皮肤脂质流动性增加。
4.皮肤刺激和毒性
皮肤表皮作为药物经皮吸收的主要屏障，其主要由角质层和活性表皮组成，
可通过傅利叶变换红外光谱法研究单萜氧类化合物角质层的影响，特别是其对角质层脂质的影响，但尚未阐明其对皮肤活性表皮的作用，目前也尚缺乏经皮促透制对皮肤活性表皮的促透作用机制研究。因此，本课题选择HaCaT角质形成细胞为活性表皮模型研究单帖氧类化合物作为促透剂对角质层细胞的影响，探讨其对皮肤活性表皮的内在作用机制。萜类化合物的毒性可以用MTT法测定检查，冰片在皮肤细胞毒性相对较低[29]。樟脑也证明了低刺激的潜力，在细胞毒性实验中，樟脑的IC50值在角质形成细胞和成纤维细胞中显著高于氮酮[30]。
5.单萜氧类经皮渗透促进剂的选择、评价及应用前景
根据药物结构及理化性质的复杂性,筛选有针对性的促渗剂始终是透皮给药研究的难点。目前主要依据药物和促渗剂各自理化性质如分子立体结构、相对分子质量、特殊官能团和两亲性等选取适宜的促渗剂,其中两亲性基团对促渗剂的选择影响较大。单萜氧类促渗剂通常含有两亲性基团,对水溶性和脂溶性药物均有较好促透作用,但因结构差异而作用各有侧重。目前单萜氧类促渗剂应用较多,单萜氧类分子小,促透效果好[26]。有效克服皮肤渗透屏障, 提高药物治疗水平和安全性始终是经皮给药系统发展的首要问题。由于单萜氧类促渗剂高效低毒、应用灵活方便,今后经皮给药系统的研发仍将以其为主导之一。研究重点将集中在:发掘更多天然萜烯类促渗剂、合成和筛选新结构萜烯类促渗剂、对水溶性及大分子药物的促透、多元萜烯类促渗剂联用、与物理促透技术及微粒载体技术联用、采用新的检测和分析技术从分子水平上阐明单萜氧类促渗剂的构效关系、促透机制并进行安全性评价。这些都有助于改进给药系统的设计, 提高药物治疗效果,降低皮肤刺激性,并进一步拓展萜烯类PE应用的剂型范围和TDDS的治疗领域。
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3. 设计方案和技术路线
实验方案： 1.查阅文献，选定9种单萜氧类促渗剂，通过Franz扩散池法，以大鼠皮为屏障，以布洛芬、水杨酸和5氟尿嘧啶为模型药物，评价单萜氧类促渗剂离体促渗效果； 2.大鼠皮肤放置室温解冻，并置于PBS中水合1h，然后固定于24孔嵌套板上，角质层朝上。皮肤下层加入0.65mLPBS溶液，临加入前加热至37℃超声脱气30min。皮肤上层加入0.15mL50%异丙醇-PBS溶液。24孔嵌套板置于37℃水浴中，插入电极，平衡两分钟后读取皮肤电阻，记为R0。滤纸条小心吸取皮肤上层溶液，加入0.15mL5%促渗剂溶液，溶剂为50%异丙醇-PBS溶液。于5、10、15、20、25、30、40、50和60min处分别读取皮肤电阻值，记为Rt。其中，上层液每隔10min换一次新鲜等温促渗剂溶液以保证促渗剂浓度不变。上述实验平行三份。通过数据分析，拟合单萜氧类促渗剂对药物促渗效果与对皮肤电阻影响的关联性 3.通过MTT法测定9种单萜氧类促渗剂不同浓度下皮肤细胞的存活率，评价单萜氧类促渗剂皮肤安全性； 4.通过傅利叶变换红外光谱法研究单萜氧类化合物角质层的影响，特别是其对角质层脂质的影响，但尚未阐明其对皮肤活性表皮的作用，目前也尚缺乏经皮促透制对皮肤活性表皮的促透作用机制研究。因此，本课题选择HaCaT角质形成细胞为活性表皮模型研究单萜氧类作为促透剂对角质层细胞的影响，探讨其对皮肤活性表皮的内在作用机制。 |
4. 工作计划
第一阶段：2017.01-02 文献阅读，完成综述，形成思路，制定实验方案；
第二阶段：2017.02-03 选取9种单萜氧类促渗剂，通过Franz扩散池法，评价单萜氧类促渗剂离体促渗效果；
第三阶段：2017.03-04 通过细胞电阻仪测定9种单萜氧类促渗剂作用下，离体大鼠皮肤电阻，拟合单萜氧类促渗剂对药物促渗效果与对皮肤电阻影响的关联性；
5. 难点与创新点
特色：
单萜氧类化合物做为促渗剂安全无毒，无刺激，作用迅速，对亲水、亲脂药物均有促渗作用，具有低浓度高促透性的特点,，在透皮给药系统中日益发挥着重要作用，拥有良好的应用前景。虽然单萜氧类促渗剂和中药挥发油同属于天然产物，但由于单萜氧类化合物是一类单一成分，因此单萜氧类化合物比中药挥发油质量更加可控，机理更加明确。
创新：
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