1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
水稻稻曲病，又名黑穗病[1]，是由植物病原真菌Ustilaginoidea virens（有性态：Villosiclava virens）引起的水稻穗部病害。
该病1879年在印度首次被报道。
19 世纪初期开始，稻曲病在中国，日本和美国也分别被报道，但是仅有零星发生，属于水稻生产中的次要病害[2]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：获得稻曲病菌Uv_3348基因的敲除突变体，为解析基因的生物学功能奠定基础。
研究内容：1、通过同源重组原理构建稻曲病菌Uv_3348基因的敲除载体；2、基于CRISP/Cas9原理构建上述Uv_3348基因的CRISP载体；3、通过PEG介导的原生质体转化方法获得上述Uv_3348基因的敲除突变体。
拟解决的关键问题：获得Uv_3348基因的敲除载体
3. 研究的方法与方案
研究方法：PCR法扩增目标同源臂序列、限制性内切酶法构建CRISP载体、PEG介导的原生质体转化法获得基因敲除突变体。
技术路线与方案：1、全基因组序列中查找目标基因序列和同源臂序列；2、分别设计同源臂特异性引物，采用普通PCR法分别扩增同源臂序列；3、Overlap PCR法扩增两同源臂连接片段，将上述片段分别克隆到pMD19-T载体；4、高保真酶扩增潮霉素HPH片段，将片段克隆到3中载体，获得敲除载体；5、采用酶切和核苷酸寡聚法构建基因CRISP载体；6、通过PEG介导的原生质体转化法共转基因敲除载体和对应的CRISP载体，获得基因敲除转化子；7、PCR法筛选验证上述转化子，获得基因敲除突变体。
实验方案：1、先构建敲除载体和CRISP/Cas9载体2、原生质体转化，获得转化子，pcr验证获得突变体3、southern blot进一步验证突变体拷贝数4、测定水稻田间致病性，看突变体致病性下降还是上升5、观察突变体表现型与野生型的异同可行性分析：（1）本人所在卵菌与真菌分子生物学实验室是我国从事植物病原物学研究历史最悠久的单位之一，对植物疫病菌、稻瘟病和稻曲病等的生物学、病理学和功能基因组学等进行了系统而深入的研究，为教育部和农业部重点开放实验室，在重点实验室建设经费的支持下，建成了配备先进的分子生物学及生物化学平台。
4. 研究创新点
采用CRISP/Cas9系统对稻曲病菌基因进行定点敲除。
CRISPR/ Cas9是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具。
CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
5. 研究计划与进展
（1）2017.9-2017．11：构建基因敲除载体和CRISP载体；（2）2017.11-2017.12：原生质体转化获得基因敲除转化子；（3）2018.1-2018.2：PCR法筛选验证转化子，获得基因敲除突变体。
（4）2018.3-2018.4:数据资料归纳及总结撰写论文。
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