1. 研究目的与意义
本项目将研制一种模拟真实病毒物理结构的高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）假病毒核酸质控品，与临床样本并行使用，实现从核酸提取到定量分析检测过程每个步骤的标准化。有研究表明我国89.6%的宫颈癌、88.0%的肛门癌、76.7%的阴道癌、53.4%的外阴癌、50.1%的阴茎癌、25.5%的口咽癌、16.2%的口腔癌和9.3%的喉癌与HPV感染有关。此外，多项研究指出，各种HPV的同时感染或先后感染是普遍现象，有研究证实，已感染HPV的患者，再次感染新HPV的风险要高于从未感染过HPV的女性，早期发现高危型HPV感染及准确分型，及时进行早期干预治疗，是提高防治效果的有效途径。
2. 课题关键问题和重难点
（1）制备以病毒为载体的高危型人乳头瘤病毒（HPV）特异性核酸序列的制备，包括核酸序列合成、质粒克隆、亚克隆进入慢病毒载体、基因测序（QC）；
（2）质控品的定值及溯源方法建立：利用Q-PCR检测引物探针与设计的核酸序列的反应效率，调节反应体系中探针、引物的浓度、退火温度等条件，优化反应体系，同时参照Q-PCR反应体系优化数字PCR法定值方法，考察数字PCR方法的线性范围。
（3）质控品的联合定值和不确定度评定：三家实验室联合定值。开展不确定度评定。
3. 国内外研究现状（文献综述）
人乳头瘤病毒是一种具有球形结构的DNA病毒，生物学分类上属于乳头瘤空泡病毒。自HPV首次发现以来，已经被鉴定出百余种亚型，不同亚型的HPV具有不同的组织侵犯特异性，如HPV1、2、14、17等亚型主要侵犯皮肤组织，引起诸如扁平疣、寻常疣等临床疾病；而HPV6、11、18、33等亚型主要侵犯黏膜组织，能够引发诸如肛门感染、宫颈癌、口腔癌等临床疾病。此外，根据HPV不同亚型致病危险程度，世界卫生组织癌症研究机构建议对HPV分为高危型、中危型和低危型，高危型HPV感染主要导致癌症等严重的疾病，中低危型通常导致皮肤感染等临床表现。中国药品监督管理局据此，将13类HPV亚型定义为高危亚型，分别为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。在高危型HPV中，世界卫生组织对我国的调查报告指出，HPV16、18、52、58、33这五种是我国最常见的HPV亚型，由HPV感染导致的宫颈癌病例中，我约有93%的病例为该五种亚型感染所致。
2021年世界卫生组织发布的宫颈癌筛查和诊断指南推荐以HPV-DNA检测方法作为首选方法，此前作为金标准的细胞学检查逐渐向更准确便捷的基因检测方向过渡。不同于其他传染性疾病的核酸检测方法主要针对于定量分析判断阳性、阴性，对HPV的检测有定量和分型的特殊要求，同时，国家药品监督管理局发布的《人乳头瘤病毒 (HPV)核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则》指出用于HPV的核酸检测试剂需具备质控品，该阳性质控品要具备与临床样本一致的核酸性质、选择临床常见及风险程度高的基因型等。应对这一需求，国内外市场上陆续出现了多种类型的人乳头瘤病毒核酸检测用标准物质或阳性质控品，包括灭活真病毒形式、质粒DNA形式、假病毒形式等。灭活真病毒通常由患者样本分离得到的人乳头瘤病毒分离灭活得到，其成本高昂，且具有一定的生物安全风险，限制了其应用范围，与灭活病毒形式的标准物质或阳性质控品相比相比，假病毒标准物质或质控品具有安全性高，易获得等优点，同时对于标准物质或阳性质控品的生产单位生物安全要求较低，相较于灭活病毒形式的标准物质或质控品，更适于作为一种量值标准；与传统的质粒DNA形式标准物质或质控品相比，假病毒标准物质或质控品具有病毒拟似结构和人乳头瘤病毒的特异性核酸序列，可以参与从病毒核酸提取到PCR结果读取的全部检测步骤，控制核酸检测结果的准确性，对于人乳头瘤病毒核酸检测的质量体系完善具有非常重要的意义。国内现有的HPV核酸检测试剂盒所用方法主要有荧光PCR法、荧光PCR熔解曲线法、PCR-荧光探针法、PCR-反向点杂交法、恒温扩增荧光法、流式荧光杂交法、杂交捕获-化学发光法、杂交捕获二代法、基因芯片法、生物芯片法、PCR毛细管电泳法、半导体测序法、酶切信号放大法等，但受限于不同检验检测机构的仪器配置和检测的便利性，仍以荧光PCR法为主流方法。
综上所述，本项目将创新研制高危型人乳头瘤病毒（HPV）假病毒核酸质控品，一方面模拟了真实病毒的物理结构，能够监控核酸提取效率，另一方面其假病毒特性不具备感染人体和自我复制的能力，具有良好的生物安全性。同时，本项目采用数字定量PCR、荧光定量PCR法相结合对高危型人乳头瘤病毒（HPV）假病毒核酸质控品进行绝对定量，保证质控品具有准确可靠的量值。
4. 研究方案
模拟了真实高危型人乳头瘤病毒（HPV）病毒物理结构：以病毒为载体，包裹高危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测的靶标基因，相较于DNA形式的质控品，病毒载体核酸质控品可以平行控制核酸检测每一步过程的质量，与临床样本并行使用，实现从核酸提取到定量分析检测过程每个步骤的标准化。
用数字PCR进行假病毒核酸质控品的绝对定量：利用Q-PCR检测引物探针与设计的核酸序列的反应效率，调节反应体系中探针、引物的浓度、退火温度等条件，优化反应体系，同时参照Q-PCR反应体系优化数字PCR法定值方法，考察数字PCR方法的线性范围。
5. 工作计划
19-1 学期第 19 周：完成任务书、开题报告。
19-1 学期第 20 周：修改任务书、开题报告。
19-2 学期第 1 周：完成任务书的确认，开始进行毕业设计。
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
