天然水体及饮用水处理过程中典型抗生素抗性基因的检测技术研究开题报告

1、目的及意义

随着各种药品以及个人护理用品的使用越来越频繁，其对环境的污染、对生态系统及人类健康的威胁也越来越重，尤其是一些抗生素滥用所造成的环境污染，近年来引起了更多的投入以及科研关注。

抗生素通常包括人用和兽用两类。我国由于人口众多，抗生素的使用一直居高不下，与此同时，近年来兽用抗生素也在养殖业和畜牧业中大量使用，因此产生的环境污染也十分严重。而环境中抗生素主要来源于医用药物和农用兽药的使用。其中医用抗生素的使用主要来源于医院，这里病人相对集中，抗生素使用较为频繁，各种排泄物和污水中均含有抗生素；其次则是通过人体排泄进入生活污水的家庭自医使用的抗生素。农用兽药中抗生素长期被添加至饲料中，但大部分都未经吸收代谢直接排放到了环境当中。

而进入环境当中的抗生素也会带来多种危害：

①进入水体中的抗生素会对藻类、鱼类以及其它水生生物产生毒性，致使其死亡，从而使得水质受到污染；

②进入土壤中的抗生素会通过淋溶、渗滤等迁移途径污染地表水、地下水和饮用水源，并通过作物吸收对植物生存造成危害；

③进入环境中的抗生素最终会通过食物链进入人体，会危及人类的生存以及健康；

④增加污水处理成本。抗生素的检测以及处理都会增加污水处理过程中的难度以及成本。

目前对水样中抗性基因的检测主要使用的是实时荧光定量PCR法。本次研究主要通过样品采集、DNA提取，并通过将样品的实时荧光定量PCR与标准曲线进行定性定量的分析。并通过实验的重复性等指标来验证检测方法的可行性。

2、国内外的研究现状分析

目前，地表水体、饮用水以及污水中有关抗生素物质的检出和污染的报道已经比较普遍。在对美国一些污水处理厂受纳污水以及河流进行检测之后，均可检测出抗生素物质在水环境中的存在，同时Winckler和Grafe发现四环素类抗生素在德国某土壤中的持久性残留浓度很高。

同时，抗生素在药物设计时主要是针对人体和动物体内的病原性致病菌，这就使其必然也对人体和环境中其他有机体产生潜在的健康威胁。Sanderson采用QSARs和现有的水生生态毒理学实验数据对226种抗生素的生态危害性进行了评价。结果表明：1/5的抗生素被预测对藻类有较大毒性，而其他大部分对鱼类和水生生物有较大毒性。而且，根据Burdene和Halling-sorensen等的研究却显示其代谢产物的毒性不能忽略。他们对养殖业经常用于治疗和促生长的九种抗生素对大型生物的生殖进行了研究，表明，其代谢产物中会有多种多样的急性以及慢性毒性。

当前，分子生物学手段的发展及分子示踪器技术的不断完善，在方法学上为抗生素抗性基因库的研究提供了极大地可能性。Chee-Sanford等研究表明，抗生素抗性基因的主要来源是动物养殖业带来的畜禽粪便污染。其中的抗生素基因可以在土壤以及地下水中迁移、传播，并很可能将抗性质粒带进食物链，最终在各个环境中迁移转化，最终使抗生素污染具有全球性。Esiobu等研究发现，将奶牛场肥料施于花园土壤中，大部分抗生素包括青霉素、四环素、链霉素的抗性基因被诱导，造成土壤中抗生素耐药性的主要原因是土壤长期适用畜禽粪便，而其中含有大量未吸收、降解的抗生素残留。在荷兰和瑞典的畜禽粪便中也发现大量抗药性优势菌群的诱导。Pruden等采用PCR定量在线实时监测技术对河流沉积物、灌溉渠、牛奶加工厂的出水、污水处理厂污水回用的排污渠以及饮用水处理厂等存在的抗生素抗性基因的浓度进行了分析，发现在人为活动干扰的环境介质中抗性基因浓度明显高于未受到人类干扰地区。抗生素抗性基因在环境中的持久性残留，以及在不同介质中的迁移、转化性能往往可能比抗生素本身的环境危害更大，因此今后应加强对该类问题的问题的科学研究。

迄今为止，抗生素基因尚未作为一种环境污染物而引起普遍关注。Pruden等首次将抗生素抗性基因作为一种环境污染物提出，并指出考虑到其可能对动植物和人体健康造成的潜在生态风险，在养殖业、畜牧业集中地区以及受影响地区应尽快开展水土壤环境介质中抗生素抗性基因的环境行为研究。

然而目前，我国由于人口密集且污水处理系统并不是很完善，畜牧业养殖生产也越来越发达，畜禽粪便的年产高达25亿吨，对畜禽粪便的处理还没有系统化，其中包含的各种抗生素随时可以进入周围环境。张瑞泉等对广东西枝江一东江流域抗生素抗性基因污染特征研究，采用实时荧光定量 PCR方法，测定了 3种代表性磺胺类耐药基因(sull、sul2、sul3)及 2种代表性整合酶基因(int1、int2)的存在及其丰度。结果显示水样及沉积物样品中sull、sul2、sul3和 int1、int2均具有 100％检出率，表明西枝江一东江流域水环境受到这5种抗生素抗性基因的污染。邹世春等对北江河水中抗生素抗性基因污染初步研究结果表明，所采集北江水域的9个样品中有5个对四环素有耐药性，7个对红霉素有耐药性， 8 个对磺胺二甲嘧啶有耐药性，定性PCR实验并经基因测序结果证实，5个样品含有sull4个样品含有sul2。进一步的PCR定量分析结果显示，7 个样品中均检出sull和 sul2磺胺抗性基因，它们与内对照基因16S-rRNA表达量比值分别在 10-2.56~10-0.52 及 10-3.25— 10-1.24 范围内，该结果显著高于美国科罗拉多州北部河流的研究结果。

因此我国的抗生素污染可能比世界其他国家更为严重，应引起足够多的重视。为全面评价抗生素污染物的生态风险及建立抗生素各种环境质量基准，对抗生素环境行为和生态毒理学方面的研究亟待加强。目前，对于抗生素在环境中的来源、迁移、转化、归趋等研究数据还十分有限，抗生素在大气、水、沉积物以及土壤介质中的环境行为及生态毒性还不是很清楚。因此，当前环境下开展抗生素在环境中的抗性基因检测的研究方法十分重要。