1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
{title}一、研究背景聚对苯二甲酸乙二酯 (PET)是一种高分子聚合物，由对苯二甲酸 (TPA) 和乙二醇 (EG) 通过酯键聚合而成的[1]。
因其耐用、价格低廉、加工方便，PET广泛应用于生产织物、一次性饮料容器等，成为了世界上使用最为广泛的合成聚酯[2, 3]。
2018年，全球PET产量达到约3.6亿吨[4]。
PET的巨大需求带来了一个全球性的问题，即如何有效地处理PET废弃物。
PET废弃物大量地进入自然环境却难以被降解，导致了白色污染。
这不仅给生态环境带来了不好的影响，甚至给人类健康带来了严峻的挑战。
在一项最新研究中，Leslie等人首次在人类的血液中检测到了可以量化的微塑料，平均1.6 μg/ml[5]。
PET其自身独特的性质给PET处理带来了巨大的难题和挑战。
传统的PET处理方法有填埋和焚烧。
但是填埋并不能使PET得到降解，而焚烧会产生许多有害的物质，如呋喃和二噁英。
而PET回收处理不仅可以减少PET污染环境，还可以通过循环利用来减少原始资源的开采。
到目前为止，PET回收处理的方法主要能够分为物理回收法，化学回收法和生物回收法[6]。
回收塑料废料最常用的方法是物理回收法。
在物理回收PET的过程中，并不破坏PET的大分子结构。
物理回收法的一般过程是破碎、洗涤、烘干、造粒、注塑成型、拉伸吹制得到最后产品等。
物理回收法工艺简单，花费较低。
但是通过物理回收法回收PET不可避免地会导致 PET 分子链的断裂的弊端以及杂质难以去除的困境，这便大大降低了PET回收后的使用性能，极大限制了回收后PET的使用范围，所以该回收方法并不能有效的促剂PET材料的再利用[7]。
而化学法就是将PET大分子解聚为小分子，一般步骤为解聚，纯化和再聚合[8]。
PET化学回收的主要目的是将PET完全降解为几种单体，例如TPA、DMT、BHET和EG[9]。
化学回收法可以分为许多种类，包括醇解、氨解、水解等，这取决于所用来断裂PET的化学试剂。
但是化学回收方法不但会消耗大量的能源，花费较高的成本，还会排放许多有毒有害物质，对环境造成二次污染[10]。
而且必须要强调的是，由于化学回收法的原材料成本、资本投入和运营规模较大，致使化学法所回收的聚合物往往比原材料更加昂贵[11]。
这种情况导致了处理PET废弃物问题的动机和意愿缺乏[12]，所以即便许多国家都有PET回收系统，但是总体回收率不到一半，只有极小部分被回收形成新的产品[13]。
近年来，生物回收法回收PET废弃物因其操作简单，节能环保而备受关注，有望发展成为未来主流的PET回收方法。
生物回收法主要通过微生物分泌的某些酶将 PET 大分子聚合物降解成水溶性小分子。
因为 PET 大分子无法进入微生物体内，所以微生物需要通过分泌一些胞外降解酶，先将 PET 大分子聚合物降解成水溶性的小分子，继而才能吸收并消化这些水溶性小分子，最终将其降解为水和二氧化碳等物质。
由此看来，这些胞外降解酶的作用是生物法的限速步骤，只有 PET 大分子进一步被水解成水溶性小分子后，微生物才能发挥彻底降解作用[14]。
目前，研究人员已经从一些微生物中分离鉴定出了能够在胞外发挥PET降解作用的酶。
这些降解酶可以将 PET 水解成对羟乙基苯二甲酸酯(MHET)、对苯二甲酸(TPA)、乙二醇(EG) 等单体小分子。
通过这些PET降解酶，不仅有望解决 PET废弃物的污染问题，而且还可以回收降解后得到的单体小分子循环利用，因此微生物酶降解法具有很好的应用前景。
到目前为止，已经有许多研究报道了多种具有 PET 降解能力的酶，包括酯酶、脂肪酶和角质酶。
但是这些酶普遍存在降解活性低、稳定性差等一系列的问题，并且缺乏降解高结晶度PET的能力，所以目前还得不到大规模应用[15]。
2016 年，日本庆应大学的一名科学家从一种名为 Ideonella sakaiensis 201-F6 的细菌中，发现了一种新型的 PET水解酶，IsPETase[16]。
值得注意的是，来自Ideonella sakaiensis 201-F6的IsPETase对PET的活性是其他酶的5.5到120倍[16]。
相比于其他PET降解酶，IsPETase 表现出了两个突出的特点。
第一，对 PET 底物的特异性高。
第二，酶活性在低温段（30~40 ℃）表现出高活性。
因此，高效的IsPETase提供了一种潜在的环保解决方案，以缓解塑料的积累。
二、研究内容与意义目前，虽然在高效表达 IsPETase 方面取得了较好的成效。
但是，PET 材料的表面具有结晶性和疏水性，而 IsPETase 表面的基团多为亲水性，所以 IsPETase 无法有效地吸附到 PET 表面， IsPETase 对 PET 的水解效果仍受到阻遏[17]。
更有甚者，当 IsPETase与 PET 材料的疏水表面相接近时，二者之间的排斥力也有可能导致酶的构象变化从而导致 IsPETase 活性中心的构象变化，导致酶活的降低乃至完全丧失[18]。
为了改善酶与 PET 材料的有效接触，Wei 等将 PET 材料破碎为粒径为 100nm 的颗粒，然后用 PET 降解酶 TfCut2 与处理好的 PET 颗粒反应，降解效率有着较为明显的提升[19]；Pellis 等对比了 PET 降解酶 Thc-cut1 对 PET 薄膜和粉末降解效果，发现在反应条件相同的情况下 PET 粉末被降度的速率更快[20]；Gamerith 以此将 PET 瓶破碎为粒径在 0.25-0.5nm 之间的颗粒，使得角质酶 Thc-cut1 能够更好地降解 PET 废弃物[21]。
这些研究都表明：可以通过减小 PET 粒径的方法使得酶与底物更好的接触，从而提高酶的反应活性和 PET 材料的降解速度，但这也无疑增加了 PET 回收处理的步骤，提高了处理成本。
另一方面，Biundo 等人则从酶改造的角度出发，将 PET 降解酶 N 端的 71 个氨基酸残基截去，使酶暴露其疏水部分来改善酶与疏水性 PET 材料的吸附，促进底物进入活性中心[22]，但是此法也同时对酶的构象产生破坏，在一定程度上降低了酶的活性。
因此，选用辅助因子介导酶与底物的结合提高 PET 水解酶的活性被认为是较为理想的方法[23]。
引人注意的是，已有文献报道在 PET 水解系统中引入疏水蛋白水解效率有所提高。
已有研究表明疏水蛋白能够提高角质酶等一些 PET 降解酶对 PET 材料的降解，通过构建融合表达载体，将疏水蛋白和 PET 酶融合表达，疏水蛋白能够有利于 PET 降解酶更好的接触到 PET 材料表面从而提高降解能力[24-26]。
这提供了将疏水蛋白与PET降解酶联用来提高PET降解的思路。
本研究的目的是基于本实验室前期构建的胞外分泌IsPETase的大肠杆菌表达体系，对重组IsPETase进行表达、纯化，并通过和疏水蛋白联用来促进PET的降解。
参考文献：[1] MARTEN E, MLLER R-J, DECKWER W-D. Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters. II. Aliphaticaromatic copolyesters [J]. Polymer Degradation and Stability, 2005, 88(3): 371-81.[2] 石利霞, 高松枫, 朱蕾蕾. PET水解酶的研究进展 [J]. 生物技术通报, 2020, 36(10): 226-36.[3] P A H, D A M, S D B, et al. Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(19).[4] CHEN Z, XIAO Y, WEBER G, et al. Yeast cell surface display of bacterial PET hydrolase as a sustainable biocatalyst for the degradation of polyethylene terephthalate [J]. Methods Enzymol, 2021, 648: 457-77.[5] LESLIE H A, VAN VELZEN M J M, BRANDSMA S H, et al. Discovery and quantification of plastic particle pollution in human blood [J]. Environ Int, 2022, 163: 107199.[6] A I I, WIM T, BOB V B. Recycling of polymers: a review [J]. ChemSusChem, 2014, 7(6).[7] 龚国华, 朱瀛波. 聚对苯二甲酸乙二醇酯废料的回收方法 [J]. 化工环保, 2004, (03): 199-201.[8] DAMAYANTI, HOSHING W. Strategic Possibility Routes of Recycled PET [J]. Polymers, 2021, 13(9).[9] RAHEEM A B, NOOR Z Z, HASSAN A, et al. Current developments in chemical recycling of post-consumer polyethylene terephthalate wastes for new materials production: A review [J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 225.[10] GEYER B, LORENZ G, KANDELBAUER A. Recycling of poly(ethylene terephthalate) A review focusing on chemical methods [J]. eXPRESS Polymer Letters, 2016, 10(7).[11] GEORGE N, KURIAN T. Recent Developments in the Chemical Recycling of Postconsumer Poly(ethylene terephthalate) Waste [J]. Industrial PEZ M D M C, PERNAS A I A, LPEZ M J A, et al. Assessing changes on poly(ethylene terephthalate) properties after recycling: Mechanical recycling in laboratory versus postconsumer recycled material [J]. Materials Chemistry and Physics, 2014, 147(3).[13] FUSAKO K, TAKESHI K, MASAYUKI O. Current knowledge on enzymatic PET degradation and its possible application to waste stream management and other fields [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2019, 103(11).[14] 李秀, 杨海涛, 王泽方. 聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶的研究进展 [J]. 微生物学报, 2019, 59(12): 2251-62.[15] KAWAI F, KAWABATA T, ODA M. Current knowledge on enzymatic PET degradation and its possible application to waste stream management and other fields [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2019, 103(11): 4253-68.[16] YOSHIDA S, HIRAGA K, TAKEHANA T, et al. A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate) [J]. Science, 2016, 351(6278).[17] ROSANO G L, ROSANO G L, CECCARELLI E A, et al. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges [J]. Frontiers in Microbiology, 2014, 5.[18] JAISWAL S, SHARMA B, SHUKLA P. Integrated approaches in microbial degradation of plastics [J]. Environmental Technology C 下放置 12 h，然后除去溶液，并在 50 ℃下用去离子水浸润洗涤 PET 薄片两次，每次 10 min，然后在室温下风干。
最后，将用疏水蛋白处理过后的 PET 薄片在含有 200 nM 的游离 IsPETase 的缓冲中（甘氨酸/NaOH缓冲液）30 ℃反应 42 h。
另一种方式是将 PET 薄片直接置于含有 200 nM IsPETase和疏水蛋白的甘氨酸/NaOH 缓冲液中在 30 ℃反应 42 h。
最终使用高效液相检测反应产物量。
4、高效液相与扫描电子显微镜分析使用C18柱（2504.6 mm，5 μm）在30 ℃下对样品进行分析，使用紫外检测器在260 nm出检测吸收值。
流动相A为含有0.1％甲酸的水，流动相B是乙腈。
在20 min时，将流动相从95％缓冲液A梯度降为为30％缓冲液A，流速为0.8 mL/min。
PET薄膜的表面形貌通过SEM电镜拍摄分析。
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
