1. 研究目的与意义
研究背景：
木质纤维素作为全球工业领域最大的可持续燃料，已成为有前途的环境资源之一，可以通过酶解、化学催化水解和发酵生产多种生物燃料，其中，酶解作为生物质利用中最环保、最有效的方法之一，近年来越来越受欢迎。
分解纤维素的纤维素酶由三种协同酶组成，分别称为内切-β-1，4-葡聚糖酶（EG）、外切-1，4-β-葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BGL）。这些酶将纤维素分解成小分子碳水化合物。BGL存在于植物、动物、真菌、细菌及古菌等体内。而微生物来源的BGL往往具有耐热等特性，在工业应用中被广泛关注。它不仅能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖，更可解除纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制，提高水解速率和程度。
由于不同来源的BGL活性差异很大，BGL 作为限速酶很容易受到温度、pH、葡萄糖及其他抑制剂的影响而被抑制甚至被灭活。因此获得比活高、产量大、热稳定性好的BGL一直是研究纤维素酶水解的热点问题。类芽孢杆菌所产BGL对木质纤维素来源的纤维二糖水解专一性较高，这对于研究纤维素的酶解机制有重要意义，故而对类芽孢杆菌BGL的异源表达及酶学性质作进一步研究。
研究目的：
（一）了解类芽孢杆菌β－葡萄糖苷酶的异源表达
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
（一）构建BGL表达工程菌并提取粗酶、纯化镍柱、过滤透析袋
（二）检验酶并研究野生BGL酶学性质
（三）测定酶的耐热性以及反应动力学参数
3. 研究的方法与步骤
研究方法和实验步骤：
采用异源表达的方法构建编码野生菌株的工程大肠杆菌，诱导表达蛋白，分析野生酶的酶学性质：
（1）BGL 表达工程菌的构建：使用 BGL 野生型序列作为模板并设计引物，质粒 pET-22b，大肠杆菌 E. coli BL21（DE3）构建表达 BGL 的工程菌株。
根据 BGL 的 DNA 序列设计了重叠延伸聚合酶反应（P CR）引物。
PCR 的条件如下：预变性（94℃，10 min），变性（94℃，30 s），退火（60℃，15 s），延伸（72℃，4 min）和终延伸（72℃，10 min）。
4. 参考文献
[1] Ketudat Cairns, J.R. and A. Esen, beta-Glucosidases. Cell Mol Life Sci, 2010. 67(20): p. 3389-405.
[2] Esen, A., Purification and Partial Characterization of Maize (Zea mays L.) beta-Glucosidase. Plant Physiol, 1992. 98(1): p. 174-82.
[3] Sue, M., A. Ishihara, and H. Iwamura, Purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside beta-glucosidase from wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Planta, 2000. 210(3): p. 432-8.
5. 计划与进度安排
1）2024-03-01～2024-03-07：查阅资料撰写开题报告；
2）2024-03-08～2024-03-09：设计类芽孢杆菌表达β-葡萄糖苷酶基因的引物；
3）2024-03-09～2024-04-11：采用异源表达的方法构建编码野生菌株的工程大肠杆菌；
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