1. 研究目的与意义
肺癌是目前世界上死亡率最高、发病率居第3位的恶性肿瘤，同时也是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。中国的肺癌发病率和死亡率远远高于世界平均水平，从总人口和发病率、死亡率的角度来看，中国和印度占世界总人口的36.3%，而发病和死亡人数占全球40.2%和42.8%[2]。我国目前肺癌的治疗仍以化放疗为主，毒副作用大，严重影响患者的生活质量，且多数患者就医时已属中晚期，传统的治疗方法不能显著提高患者的5年存活率。而中医药在这一方面以其减毒增效、扶正祛邪等方面的巨大优势发挥了重要作用。
中药复方ZSP作为一种防癌新药，对人类食管癌和口腔癌有显著的化学预防效果[3-4]，有研究结果显示[5]，ZSP对肺癌也有一定的化学预防效果，能够显著减少具有P53突变和INK4A/ Arf缺失小鼠的肿瘤多样性和肿瘤负荷。
现有中药复方治疗肺癌的机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、影响肿瘤细胞的微环境以及逆转肿瘤细胞多药耐药的作用、抑制肿瘤血管生成、调节机体免疫功能以及影响信号传导通路等等[6]。其中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种能够促进炎症反应的重要因子，其能通过直接消灭癌症细胞从而达到促进肿瘤部位坏死的目的，并对正常细胞无毒副作用[7]，但近年来有研究证实[8-9], 肿瘤微环境TNF-α中长期表达可使肿瘤细胞进一步恶化；IL-1β功能主要作为内源性热源参与炎性反应, 随着近年来研究发现，IL-1β与肿瘤密切相关, 并且在肿瘤的发生、转移中具有重要意义[10-11]；IL-6是具有广泛生物活性的一种效应细胞因子, 主要由活化的巨噬细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等细胞产生, 并且肿瘤自身也可分泌IL-6, 从而对肿瘤的发生、侵袭、转移及增殖具有重要调节作用[12]。
2. 文献综述
中药复方防治肺癌的作用及其机制的研究进展
[摘要]肺癌目前是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。现有中药复方治疗肺癌的机制一般包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤血管生成、逆转肿瘤细胞的多药耐药作用、调节机体免疫等。Lewis肺癌小鼠模型是目前抗肿瘤药物研究最常用、最理想的模型。基于中医肺与大肠相表里理论把大肠的病理变化纳入防治肺癌的研究中，是中药复方防治肺癌研究中具有重要意义的新思路。
[关键词]肺癌；中药复方；作用机制；肺与大肠相表里
3. 设计方案和技术路线
研究目标
基于Lewis肺癌模型研究中药复方ZSP抗肺癌作用
研究方案
第一部分：Lewis肺癌小鼠模型的建立
液氮冷冻的小鼠 Lewis 肺癌瘤株于37℃水浴中复苏后，于C57BL /6 小鼠右腋下接种，一周后后颈脱臼处死，固定于鼠板上，常规消毒，于超净工作台中，从腋下皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加4℃PBS缓冲液（按癌细胞株∶生理盐水为1∶10的比例），轻轻研磨过滤，制成瘤细胞悬液，0.4%台盼蓝计数，细胞活力大于95%，调整细胞为1107/ml。以上述瘤细胞悬液0.2ml于右腋皮下注射，建立模型[1]。
第二部分：ZSP给药剂量筛选实验
1.实验动物分组：空白组、模型组、阳性药组（顺铂）、ZSP-1（低剂量组）、ZSP-2（中剂量组）、ZSP-3（高剂量组）、ZSP-4（大剂量组）
2.给药：ZSP1-4的给药剂量依次为20、35、50、65g/kg，灌胃给药，1次/d，连续14d；顺铂组：2mg/kg腹腔注射给药，隔日一次，连续14d；空白组和模型组给于同等体积的纯水，1次/d，连续14d。所有动物的给药体积均为0.4ml/20g。
3.检测指标：小鼠体重及生存状况、抑瘤率
优选ZSP最佳给药剂量。
第三部分：基于最佳优选剂量的中药复方ZSP治疗肺癌作用药效学评价[2-5]
1.实验动物分组及给药：空白组、模型组、阳性药组（顺铂）、ZSP组。ZSP组采取上述优选最佳剂量，其余同上。
2.ZSP对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长和体质量的影响
实验前及实验后给小鼠称重，颈椎脱位法处死小鼠，取出完整肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（模型组平均质量-实验组平均质量）/模型组平均质量100%
组别 | 剂量（g/kg） | 体质量/g | 瘤质量/g | 抑瘤率/% | |
实验前 | 实验后 | ||||
空白组 | - | ||||
模型组 | - | ||||
顺铂组 | 0.002 | ||||
ZSP组 |
3.ZSP对Lewis肺癌小鼠脾脏、胸腺指数的影响
脾脏指数=脾脏重量/体重100%；胸腺指数=胸腺重量/体重100%
组别 | 剂量（g/kg） | 脾脏指数/% | 胸腺指数/% |
空白组 | - | ||
模型组 | - | ||
顺铂组 | 0.002 | ||
ZSP组 |
1.ZSP对Lewis肺癌小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的影响
以ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，操作严格按试剂盒说明书进行。
组别 | 剂量（g/kg） | TNF-α（ng/L） | IL-1β（ng/L） | IL-6（ng/L） |
空白组 | - | |||
模型组 | - | |||
顺铂组 | 0.002 | |||
ZSP组 |
第四部分：中药复方ZSP对肺癌小鼠肠粘膜的影响
1.实验动物分组及给药：空白组、模型组、阳性药组（顺铂）、ZSP组。ZSP组采取上述优选最佳剂量，其余同上。
2.样本采集与处理：沿小鼠腹正中线剪开腹部皮肤，充分暴露直肠、结肠部分，自耻骨联合处至盲肠取下小鼠整个结肠，用生理盐水清洗结肠，置于4％多聚甲醛固定液中固定24h[6].
3.HE染色法观察肠黏膜形态[7]
采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)对组织切片进行染色，光学显微镜下观察各组大鼠结肠组织形态学变化。HE染色主要步骤包括：脱水、浸蜡、包埋，切片，展片，烤片，HE染色。
4.Western-Blot法检测肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白表达水平[8]
第五部分：数据处理与分析
数据采用 SPSS 21.0软件统计分析，计量数据多组间比较采用方差分析，两组间比较实施 LSD-t检验，P 为差异有统计学意义。
技术路线
参考文献：
[1]段宇航，李嘉，陶晨凯，等.化疗联合四逆汤对C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长的影响[J].环球中医药，2018，11（11）：1666-1669.
[2]李仪奎. 中药药理实验方法学[M]. 上海：上海科学技术出版社，2006.23-25.
[3]Ke X, Wu M, Lou J, et al.Activation of Toll-like receptors signaling in non-small cell lung cancer cell line induced by tumor-associated macrophages[J]. Chinese Journal of Cancer Research, 2015, 27(2):181-189.
[4]赵益，刘燕，蓝希明，等. 铁皮石斛提取物对胃癌癌变的抑制作用及机制研究[J]. 中草药，2015，46（24）：3704-3709.
[5]段宇航，李嘉，陶晨凯，等. 化疗联合四逆汤对C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长的影响[J]. 环球中医药，2018（11）：1666-1669.
[6]王伟松，夏旭婷，刘富林，等.枳术丸对脾虚证慢传输型便秘小鼠肠道运动及PLC-γ1/PLC-γ2信号通路的影响[J/OL].中国实验方剂学杂志，2019，2（27）：1-8.
[7]张霁，吴丽洁，李志元，等.隔药灸对克罗恩病大鼠结肠NLRP3炎症小体及IL-1β调节作用的实验研究[J/OL].上海针灸杂志,2019（02）：119-126.
[8]石玉莹，唐洪梅，吴映秀，等.肠激安方对IBS-D大鼠肠道通透性的影响[J/OL].中国实验方剂学杂志，2019，2（28）：1-6.
4. 工作计划
2022年1月-2月：文献检索、实验方案和实验材料准备
2022年3月：建立Lewis肺癌小鼠模型、ZSP剂量筛选
2022年4月：ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平
5. 难点与创新点
1.基于Lewis肺癌小鼠模型研究中药复方ZSP治疗肺癌作用，为中药复方ZSP的二次开发提供理论基础；
2. 本实验基于中医肺与大肠相表里理论把大肠的病理变化纳入肺癌的研究中，以期为中药复方防治肺癌的研究提供新的研究思路。
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