大枣三萜酸类成分药代动力学研究开题报告

1. 研究目的与意义

大枣（JujubaeFructus），又名红枣、枣，为鼠李科(Rhamnaceae)枣属（Ziziphus Mill）植物枣(Ziziphusjujuba Mill)的干燥成熟果实。大枣味甘、性温、无毒，归脾、胃、心经。大枣久食或入药膳，有补气血、益脾胃、通九窍、润肤养颜、延年养生之保健功效，为中医临床补脾益胃及食疗保健常用之品。

现代研究显示，大枣中含有三萜酸类、多糖类、神经酰胺类、核苷类、氨基酸类、等多种化学成分，且多糖及三萜酸类物质均有不同程度的抗肿瘤、保护肝脏活性，与其临床治疗及保健功效密切相关，目前认为其为大枣发挥传统功效的主要物质基础。其中，大枣中含有的三萜酸类物质构型多样、数量较多，且对肿瘤细胞具有高度选择性，成为近年来抗肿瘤药物研究的热点，具有较大开发价值，但其体内过程及尚未阐明，严重制约了该类资源的产品开发与资源有效利用。

鉴于此，本研究采用动物病理模型，利用LC-MS技术，研究大枣三萜酸类组分吸收、分布、代谢、排泄过程，为阐明和揭示其作用机制及设计和优选给药方案、促进新药开发和剂型改进，以及为探索中医药防病治病机理开辟新的研究方法和思路均具重要意义。

2. 文献综述

大枣三萜酸类成分及其药代动力学研究进展

华婷婷

（南京中医药大学/药学院中药资源与开发江苏南京 210023）

摘要：大枣植物中化学成分较复杂，自20世纪80年代以来，从大枣植物中发现的化合物已有70多种。对大枣植物化学成分的研究主要集中于三萜酸、皂苷、生物碱、黄酮及糖苷类等成分。近年来的研究发现，大枣中含有的多糖及三萜酸类物质均有不同程度的抗肿瘤作用,大枣中含有的三萜酸类物质所表现出的细胞毒性,具有对肿瘤细胞高度选择性的特点，成为近年来抗肿瘤药物研究的热点,具有较大的开发价值。

关键词：大枣；三萜类；活性成分；药理作用；药代动力学

大枣（JujubaeFructus），又名红枣、枣，是鼠李科(Rhamnaceae)枣属（Ziziphus Mill）植物枣(ZiziphusjujubaMill)的干燥成熟果实。历代医药、食疗典籍均对大枣的营养、保健价值作了十分精辟的阐述。大枣味甘、性温、无毒，归脾、胃、心经。大枣既是普通食品，也是常用的药品，久食或入药膳，有补气血、益脾胃、通九窍、润肤养颜、延年养生之保健功效。近年来，国内外学者研究主要集中于对大枣的药用部位即大枣果肉的研究，各类成分中，又以三萜类、糖类及核苷类成分研究报道较为多见。大枣中所含有的包括齐墩果酸在内的三萜酸类成分具有抗肿瘤、兴奋免疫、保肝降脂等药理活性，在该类成分中又以羽扇豆烷型三萜酸类成分为其主要组分，其代表性化合物白桦脂酸在大枣中具有含量高、药理活性明确、对照品容易分离纯化等特点，应用前景广泛。

1．三萜类成分(Triterpenoids)

枣属植物中的三萜类成分按是否与糖结合，分类为游离型三萜类及与糖结合形成的三萜皂苷类，多分布于果肉、种子及叶中。其中的游离型三萜类化合物主要以羽扇豆烷型、齐墩果烷型、乌苏烷型及美洲茶烷型等五环三萜类化合物为主。到目前为止常见的化合物有羽扇豆烷型的白桦脂酸(betulinic acid)、麦珠子酸(alphitolic acid)和白桦脂酮酸(betulonic acid)；齐墩果烷型的齐墩果酸(oleanolic acid)、马斯里酸(maslinic acid)和齐墩果酮酸(oleanonic acid)；乌苏烷型的熊果酸(ursolic acid)、2α-羟基乌苏酸(2α-hydroxyursolic acid)和乌苏酮酸(ursonic acid)，以及19位具羟基的坡模堤酸(pomolic acid)和坡模堤酮酸(pomonic acid)等；美洲茶烷型的美洲茶酸(ceanothic acid)、表美洲茶酸(epiceanothic acid)、大枣新酸(zizyberanal acid)、zizyberanalic acid、zizyberenalic acid和ceanothenic acid等^[2]。此外，尚有2位或3位羟基的芳香酸酯化产物^[3]。其中，美洲茶烷型化合物被认为是由2，3位邻羟基羽扇豆烷型化合物经水解，A环开环后重新闭合为五元环而形成的产物，是目前发现自然界较为少见的一类三萜酸类化合物，主要分布于鼠李科，可认为是枣属植物的特征性成分。

三萜酸类化合物有较高的脂溶性，分子量一般为400~600 Da，化学结构复杂,目前已知有7种不同的母核结构在母核上有多个不同的取代基，常见有羧基、羟基、酮基、甲基、乙酰基和甲氧基等^[4]。刘孟军课题组^[5-7]对于大枣中三萜酸类物质采用超声提取法对多个枣品种中熊果酸进行提取检测；研究结果显现熊果酸在不同枣品种中分布广泛，平均含量最高的为鲜食品种^[8]。段金廒课题组对大枣中分离得到的两种三萜酸进行结构分析^[9]，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(DAD)在两个波长下同时检测10种三萜酸类化合物；接着利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器串联质谱(HPLC-ELSD-MS)检测用氯仿提取的大枣中三萜酸类化合物，比较了大枣果肉和果核中三萜酸化合物含量，得出果肉中的含量明显多于果核的结论。鉴于上例，三萜酸类化合物多用微波辅助有机相提取^[7]，检测方法早期为紫外分光光度法^[10]，现在多用HPLC法^[11]，也有将灵敏度更高的液相色谱串联质谱应用于三萜酸类物质的检测。

目前大枣中已分离得到的三萜类化合物化学结构见图1和表1。

Ⅰa Ⅰb

Ⅰ羽扇豆烷型

Ⅱ齐墩果烷型(Oleanane type)

Ⅲa Ⅲb

ⅢCeanothane type

图1大枣中含有的三萜类成分结构母核

表 1 大枣植物中的三萜酸类化学成分

2药理作用

2.1抗肿瘤作用

研究表明，熊果酸对小鼠S180肿瘤具有明显抑制生长作用，能抑制白血病细胞HL-60^[12]、抑制并杀伤人红白血病细胞系K562细胞^[13]和人舌鳞癌细胞株TSCCa细胞增殖^[14]，其作用机理是抗增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。熊果酸对KB肿瘤细胞、人结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7和CCRF-CEM同样具有细胞毒性作用^[15]。有诱导肿瘤细胞凋亡，对多种肿瘤细胞具有选择性细胞毒性抑制COX-1、COX-2活性^[16]。

2.2保肝作用

在20世纪70年代发现经齐墩果烷治疗后的四氯化碳中毒大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）明显下降。80年代通过组织病理学的检查进一步证实了齐墩果烷的保肝作用^[17]。对CCl₄所致的肝损伤具有保护作用，降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性^[16]。

2.3抗炎作用

白桦脂酸及其衍生物能通过抑制炎症过程中具有重要作用的磷脂酶A2（PLA2）的活性，从而抑制炎症进展^[18]。对TPA、血管缓激肽等多种炎症介质引起的炎症具有抑制作用^[16]。

2.4抗HIV

熊果酸对HIV-1蛋白酶活性有强的抑制作用^[19]。对桦木酸进行结构改造，将C3位羟基改造成酯，可提高抑制HIV-1的活性^[20]。近年又证明齐墩果酸具有抑制艾滋病病毒作用，在H9淋巴细胞中抑制HIV的复制。

2.5抗微生物

对分枝杆菌、疟原虫及多种微生物具不同程度的抑制作用。孙华等在齐墩果酸类化合物的结构改造及抗癌活性研究中表明3-表熊果酸和3-表齐墩果酸具有抑制分枝杆菌(antimycobacterial)活性，最小抑制浓度(MIC)分别为8和16μg/ml；齐墩果酸具有抑制微生物B.subtilis(MIS=8μg/ml)以及吲哚美辛敏感的(MIS=8μg/ml)和不敏感的(MIS=64μg/ml)S.aureus的活性；齐墩果酸和熊果酸具有杀锥虫(trypanocidal)活性；熊果酸在最小浓度(MC)88μM就能抑制T.cruzi的活动，齐墩果酸活性比熊果酸稍差^[21]。

3药代动力学研究

药物代谢动力学研究，对阐明和揭示药物作用机制及其科学内涵、设计和优选其给药方案、促进新药开发和剂型改进以及为探索防病治病机理开辟新的研究方法和思路均具重要意义。20世纪80年代初期，为了避免体内药物浓度法的局限性，出现了以药效为指标，药效的变化取决于体内药量的变化为基本原理进行药代动力学研究的方法，可以通过测定药效的经时过程来反映体内药量的动态变化，其优点是以生物学效应的强度反映药物在体内的动态变化，可忽略中药化学成分的复杂性；其动力学参数对临床具有显著意义。^[22]

药代动力学研究的关键在于选择和建立具有简单、准确可靠、高灵敏度和高选择性的定量分析方法。由于药物在生物样品（包括血液、尿液、组织样品等）中的含量相对较低，而且取样量有限，加之生物样本中内源性化合物存在基质效应的干扰，所以建立的分析方法应满足高选择性、高灵敏度等条件。目前，LC-MS技术由于兼备液相色谱强大的分离能力和质谱高灵敏度、高选择性等特点，可在短时间内完成常规的药物和代谢物的定性、定量分析，是现代药物代谢及动力学研究中体内药物分析的首选方法。

3.1羽扇豆烷型

目前国内学者基于药代动力学对白桦脂酸的抗肿瘤活性研究较多。张秀娟^[23]等在桦木酸体内抗肿瘤作用的初步研究中通过限量实验确定桦木酸的给药剂量；动物随机分为6组，分别为桦木酸500、250、125mg/kg剂量组，灌胃给药0.4ml/只，观察14d，环磷酰胺(20mg/kg)为阳性对照。观察生命延长时间与瘤重抑制率紫外分光光度法测定Ca² 、Mg² -ATP酶活性；研究桦木酸对H22、S180小鼠肿瘤细胞药效学作用及对肿瘤细胞膜Ca² 、Mg² -ATP酶活性的影响。结果显示桦木酸抗肿瘤作用机制与其上调肿瘤细胞膜p53蛋白的表达，改变肿瘤细胞膜Ca² 、Mg² -ATP酶活性有关。也说明了其作用对剂量没有依赖性。

Gautam Mishra Manoj Kumar SinghAnshumaliAwasthi Manu Jaggi Farhan J. Ahmad^[24]开发和验证了HPLC测定新型桦木酸DRF-4012大鼠血浆；成功地确定DRF-4012浓度的大鼠血浆中的药代动力学和静脉内给药后的毒性药代动力学研究1mg/ml DRF-4012纳米颗粒制剂在Wistar大鼠中为2-10mg/kg。此方法成功使用小样品体积（100μL）。验证了可应用于更高的药代动力学线性研究；DRF-4012的药代动力学特征大鼠静脉注射剂量为5mg/kg，其低溶剂消耗（500μL）和相对短的色谱运行（15min）表明此方法也适用于高通量定量分析，如检测这种化合物在临床患者中的血浆水平。

3.2齐墩果烷型

陈洪轩^[25]等在齐墩果酸脂质体在大鼠体内药代动力学的研究中采用乙醇注入-探头超声法制备齐墩果酸脂质体；鼠分别尾静脉注射齐墩果酸脂质体和齐墩果酸溶液剂，用反相高效液相色谱法测定不同时间血浆中齐墩果酸的浓度研究齐墩果酸脂质体在大鼠体内的药代动力学。结果齐墩果酸脂质体显著增加了齐墩果酸的AUC延长了其在血液循环中的时间。研究表明了可用一种简单的方法制备具有多重优点的OA脂质体注射剂，为OA 临床用药提供一种高疗效的制剂品种。

廖敬礼^[26]等在唐古特青兰提取物齐墩果酸的药代动力学研究采取甲醇-水(85∶15,V/V)为流动相，DiamonsilC₁₈柱(250mm4.6mm，5μm)为固定相，紫外检测波长为215nm测定,大鼠灌胃给药3.0，1.5g/kg用HPLC法测定齐墩果酸血浆浓度研究唐古特青兰醇提取物中齐墩果酸的药代动力学规律。结果大鼠灌胃高剂量和低剂量给药的齐墩果酸主要参数分为AUC0-t为49450.915mg/(Lmin)和37336.884mg/(L min)，t_l/2为85.154min和55.215min。对大鼠灌胃唐古特青兰的醇提物齐墩果酸，用高剂量组和低剂量组灌胃给药，这两种剂量的半衰期，清除率基本一致，无毒性反应现象，说明给药剂量合理，线性关系良好，在大鼠体内吸收、消除较快，代谢迅速，所得结果可为临床合理用药提供科学依据。

王颖^[27]等在山楂酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制研究中50只SPF级小鼠随机分为正常组，模型组，山楂酸高、中、低剂量组(200、100和50mg/kg)。山楂酸药物处理组连续灌胃给药7d。第7天给药后，除正常组腹腔注射等量生理盐水外，其他各组均腹腔注射CCl₄以制备小鼠急性肝损伤模型。造模完成后，正常组和模型组继续灌胃给予等量的生理盐水，而山楂酸高、中、低剂量组继续灌胃给药3d后，于光镜下观察肝组织的病理变化；结果表明100、200mg/kg MA对CCl₄导致的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与MA激活Nrf2-Keap1信号通路以增强机体清除氧自由基的能力，以及通过抑制NF-κB通路以降低致炎因子的释放而发挥肝脏的保护作用有关。

3.3乌苏烷型

熊果酸又名乌苏酸，目前，国内学者正在研发熊果酸的不同剂型以改变其在体内的吸收，剂型的改变可增加脂溶性而增加熊果酸的吸收^[28]，熊果酸吸收少有可能与药物转运体的外排有关。

杨巧虹^[29]等关于熊果酸灌胃给药大鼠体内药代动力学研究中通过HPLC法测定熊果酸的血药浓度，检测波长为221nm，流动相为乙腈－0.1%磷酸水溶液(78.5∶21.5)。结果大鼠单剂量灌胃给药20mg/kg熊果酸提取物后，熊果酸的体内研究过程符合一室模型，约1.0h达峰，吸收较迅速；消除较慢，峰浓度(C_max)为(35.648.63)μg/ml，消除半衰期(t_1/2)为(4.4211.835)h。该研究为将来口服制剂的处方设计和质量评价奠定了基础。

4小结

中药药代动力学，是指在中医药理论指导下，利用动力学的原理与数学处理方法，定量地描述中药有效成分通过各种给药途径进入机体后的吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律。大枣三萜酸类的抗肿瘤作用呈现多部位、多环节、多靶点的特点，既能使药物长时间持续发挥效力，又能延长患者生命，有望成为新一代的抗肿瘤药物。进行三萜酸类代表性成分的药物代谢动力学探究，建立药物代谢动力学方法，测定其药效的经时过程来反映体内药量的动态变化，将为保证大枣临床疗效提供保障。

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3. 设计方案和技术路线

研究方案

1. 大枣中三萜酸类化学部位的制备

拟采用常规热回流提取法、萃取法进行三萜酸类化合物的富集。应用HPLC-ELSD、UPLC-TQ等技术对该化学部位含有的三萜酸类化学成分进行分析。

2. 三萜酸类代表性化合物的药物代谢动力学的方法建立

由于体内药物浓度法的局限性，可通过测定生物效应进行药代动力学研究的方法，其基本原理是以药效为指标，药效的变化取决于体内药量的变化，因此可以通过测定药效的经时过程来反映体内药量的动态变化，以生物学效应的强度反映药物在体内的动态变化。基于LC-MS技术可以在短时间内完成常规的药物和代谢物的定性、定量分析，深入探究此类药物体内吸收障碍。

研究技术路线

4. 工作计划

2022年3月-4月进入实验室熟悉常规实验流程；制定实验方案，书写开题报告；样品收集。

2022年4月-5月按照既定实验方案进行实验研究。

5. 难点与创新点

本研究基于中药资源化学的研究思路与方法，在对我国传统常用中药大枣三萜酸类化学成分进行分析的基础上，对其三萜酸类代表性成分进行药物代谢动力学探究，从往昔国内外学者研究的基础上，采用满足高选择性、高灵敏度等条件的LC-MS技术，可以在短时间内完成常规的药物和代谢物的定性、定量分析的优点，建立药物代谢动力学方法，测定其药效的经时过程来反映体内药量的动态变化，以期为药物活性成分的明确及药物活性成分的体内有效吸收提供支撑。

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