1. 研究目的与意义
研究内容：
本研究拟采用SDS一聚丙烯酞胺蛋白电泳（SDS-PAGE）的方法，研究19KD至21KD的分子量在不同浓度（10%、12.5%、15%、17.5%）
下SDS-PAGE电泳的最适跑胶时间（分条上、条中、条下），用以揭示条带的清晰度完整性以及条带之间的分离度。
2. 文献综述
SDS-PAGE在KGF2项目中的分析探讨
张习 130203324 中药学
摘 要 随着生物技术的日益进步和发展, 隶属生物技术中的角质细胞生长因子-2(Keratino Gytegrowth factor-2,KGF-2中的一员也必然处于发展之中。本文通过SDS-PAGE的实验方法研究不同分离胶浓度的最适跑胶时间来判断条带之间的分离度、完整性、清晰度，并以此判断是否需要继续发酵或纯化，继续使用MTT法对生物活性进行检测，使之生物活性达到最大，将其应用于研制KGF-2新药的实验，将成为研究KGF-2项目的未来的一大优势。
关键词 角质细胞生长因子；破坏性实验;SDSPAGE电泳法；MTT法活性检测
前言
生物医药被公认为21世纪最有前途的产业之一，对未来的社会和经济具有举足轻重的意义。根据资料显示，现阶段世界生物技术尤其是医药生物技术发展开始进入大规模产业化阶段，生物技术药物给予了人们很好的选择，它们往往能够奇迹般地改善病人的生活质量。因而生物医药产业己成为目前世界五大支柱产业之一。有人预言：对改造世界的影响,生物技术远远超过当年的工业革命。随着生物技术的日益进步和发展，利用基因克隆技术基因组学蛋白质组学生物信息学等相关技术，构建己知或未知的蛋白并进行功能与性质的研究己成为可能。美国Science杂志1999年曾评论角质细胞生长因子可能是生长因子家族中最具药用价值和其他开发价值的因子。作为一种具有多功能的细胞生长因子，已越来越引起国内外研究机构及生产企业的青睐。
正 文
生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，是分子生物学和医学研究的一个重要领域。角质细胞生长因子-2(keratinocytegrowthfactor-2,KGF-2)又称为成纤维细胞生长因子-10(FGF-10),是FGFs家族中角质细胞生长因子(keratinocyte growth factors,KGFs)亚家族的一员,KGFs亚家族目前有两个成员,即KGF-1和KGF-2,1989年Rubin等首次从人胚肺成纤维细胞培养液中分离纯化的一种细胞因子,分子量约为26-28KD的单链多肤,因其对上皮细胞的专一性和对角质细胞的特异敏感性.被命名为角质细胞生长因子(KGF), 1966年Yamasaki等从鼠的胚胎中扩增出一种新的生长因子叫作成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)。它与KGF具有同样的受体特异性,而且氨基酸序列具有53%的同源性,因此又被称为KGF-2。与其它FGFs的不同在于KGFs都能与上皮细胞表面的受体FGFRZ一Ⅲb结合,并促进上皮细胞的生长、增殖和分化。
下表为FGF家族成员及其受体：
名称 别称 亲和受体类型 |
FGF-7 KGF-1 FGFR2-Ⅲb FGF-10 KGF-2 FGFR1-Ⅲc;FGFR2-Ⅲc;FGFR4 |
表1 FGF家族成员及其受体[6]
1.来源
KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌,如成纤维细
胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的Y6T细胞均可分泌KGF-2。此外,上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。
2.研究进展
近年来，FGF家族中许多因子(aFGF、bFGF等)被国内外众多的学者研究并认同其在组织生长与损伤修复过程中的作用和机制，广泛应用于创面愈合、组织修复、血管再生及美容抗衰老等领域，但因其具有的广谱促有丝分裂活性(这对创伤的修复非常重要)，可以促进正常细胞甚至肿瘤细胞的大量增殖的体内用药安全瓶颈问题，仅限于外用药物，使其临床应用受到很大局限，在已上市的成纤维细胞生长因子家族中，碱性成纤维细胞生长因子与酸性成纤维细胞生长因子在我国率先实现了应用于临床。
3.研究方法
3.1 SDS-PAGE的原理
SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)作为对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的经济、快速、且可重复的方法, 是蛋白质分析中最常用的方法。SDS-PAGE分离蛋白质并不取决于蛋白质分子的电荷密度,而取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小,也即决定于蛋白质或亚基的分子量大小。因此,凝胶浓度的正确选择对电泳鉴定效果尤为重要。不同分子量范围的蛋白质应选择不同的凝胶浓度。采用不连续系统，同时配制了 10%、12.5%、15%以及17.5%的分离胶，研究不同浓度的分离胶对分离效果的影响[9]。在样品和凝胶中加入SDS（阴离子去污剂）和二硫苏糖醇DTT（还原剂）后，蛋白质亚基之间的非共价键被解离，使其解离成单个的亚基，单个的亚基能与蛋白质结合成带负电荷的复合物。所带的负电荷大大超过了蛋白质原来所带电荷，就消除了蛋白质之间原有的差别，因而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
3.2 MTT法实验原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）[7]。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO或无水乙醇来溶解。
4.应用前景
目前，国内外很多研究单位和生产企业已着手进一步拓展成纤维细胞生长因子的应用领域，在抗肿瘤心血管疾病（如冠心病）神经系统疾病（如帕金森症老年痴呆症）以及抗辐射、提高免疫功能等方面进行着广泛而深入的研究。国外用于静脉溃疡化疗引起的勃膜炎及溃疡性大肠炎治疗已进行H期临床实验；国内开发的外用冻干粉及生物流体膜剂型，用于抗溃疡及促伤口愈合，也已进入临床阶段。成纤维细胞生长因子是一个多基因家族，到目前为止，发现FGF超家族共有25个成员，它们在一级的氨基酸序列上有一定的同源性及类似的生物学功能，尽管许多因子在组织中的作用机制仍不太清楚，但研究发现在生理和病理组织中KGF家族中许多因子有表达或高表达，。因此具有广泛的研究和应用一前景。
本文研究主要通过发酵（纯化）后的样品，在HPLC做定性实验，在紫外分光光度计（UV）下测得280/260nm处的吸光度（A），根据此处的吸光度(A)估算目的蛋白含量，以此确定上样量，利用SDS-PAGE电泳法在不同分离胶浓度10%、12.5%、15%、17.5%下跑胶得到胶图，根据胶图上条带的完整性、清晰度和条带之间的分离度，估算 KGF-2的最适时间并用MTT法检测生物活性。
5.问题与展望
角质细胞生长因子-2中普遍存在问题是蛋白可溶性表达量低及产物量低，生产工艺繁琐，回收率及蛋白稳定性差，已成为严重影响其实现工程化的瓶颈，因此，对KGF-2的工程化研究具有重要的意义。而要将基础研究成果进行中试放大，实现产业化，还需解决许多技术上的困难，因为它不仅与上游表达系统构建相关，还与下游发酵、纯化等各环节均有密切关联。同时由于生物制品的特殊性，包括稳定性、生物学活性及安全性等，还需建立相应的检测方法与质量标准，目前通常采用细胞增殖 MTT 实验检测重组KGF-2 的生物活性， 但还没有统一的细胞系标准。这使得许多科研成果仅限于基础研究，停留于实验室研究水平，不能满足企业生产和商品化的需要。
鉴于KGF-2在急性手术伤口静脉溃疡、胰腺炎性肠道疾病及口腔和肠道勃膜炎等有很好的治疗效果，以及它本身所具有的修复损伤、促伤口愈合、抗辐射等各种有益作用的基础上，研究KGF-2并使其用于各种疾病的治愈，将成为未来一大趋势。
参考文献
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3. 设计方案和技术路线
设计方案见附件
4. 工作计划
2022.1-2022.2 文献检索、熟悉课题研究背景
2022.2-2022.3 用UV测估算蛋白含量
2022.3-2022.5 用SDS-PAGE跑胶得胶图、HPLC测得图谱
5. 难点与创新点
UV、HPLC、SDS-PAGE法与MTT比色法结合。
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