1. 研究目的与意义
目前银杏内酯被认为是最有临床应用前景的天然血小板活化因子( PAF 是血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂) 受体拮抗剂，其拮抗作用活性与化学结构密切相关。实验证明银杏内酯结构中R3为羟基或羟基数目增多时，对 PAF 的拮抗活性减弱; 而当R2为羟基且R3为H 时，则活性显著增强，其中以银杏内酯B对PAF产生的拮抗作用最强，银杏内酯B的药理作用研究也最为深入。
2. 文献综述
银杏内酯组分自微乳的制备及评价
田燕*（南京中医药大学，江苏 南京 210023）
[摘要]银杏内酯（ginkgolides）是银杏（Ginkgo biloba）根皮及叶的强苦味成分，已分离出银杏内酯A、B、C、M、J（ginkgolide A、B、C、M、J）。银杏酯对血小板活化因子(PAF)受体有强大的特异性抑制作用，其中银杏内酯的抗PAF活性最高。PAF是血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂，而银杏内酯目前被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂。本文以自微乳化释药系统为载体制备银杏内酯组分的自微乳化制剂,并对其质量及药效等作出评价。
[关键词]银杏内酯；自微乳化；质量评价
1前言
银杏 Ginkgo biloba L. 系银杏科植物， 在我国已有600 多年的药用历史[1]。 国内外学者对银杏的化学成分、药理作用及其应用做了大量研究工作，研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一， 对心脑血管疾病具有独特的药理作用， 广泛应用于治疗和预防心脑血管疾病。目前银杏内酯被认为是最有临床应用前景的天然血小板活化因子( PAF 是血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂) 受体拮抗剂[2]，其拮抗作用活性与化学结构密切相关。
银杏内酯A(ginkgolide A；GA)、银杏内酯B(ginkgolide B；GB)、银杏内酯C(ginkgolide C；GC)、银杏内脂M(ginkgolide M；GM)、银杏内脂J(ginkgolide J；GJ)为二萜类化合物，其差别在于含有的羟基数目和羟基连接的位置不同。
微乳释药系统（microemulsifying drug delivery system）是液滴粒径为10~100nm的液体分散体系。微乳属于热力学稳定体系，但长期贮存易发生微生物污染，微乳中的辅料在溶液中也易氧化、水解,以致影响稳定性和安全性。近年随着研究的深入,在微乳的研究基础上发展建立了自微乳释药系统[3]（self-microemulsifying drug delivery system,SMEDDS）, 由乳化剂、助乳化剂和油相组成,基本特征是在胃肠蠕动或环境温度(通常指体温)及温和搅拌下能 自发形成粒径 10~100nm、各向同性的透明或半透明o/w 型分散体系 [4]。目前研制的SMEDDS多将自微乳浓缩液灌装于软胶囊或可充液硬胶囊中[5],或直接以液体形式服用,不是严格定义上的微乳[6]。
理论上 ,SMEDDS适用于生物药剂学分类系统（biopharmaceutical classification system,BCS）中的每种药物 [7] ,可帮助解决口服给药中的问题[8]:①酶降解;②肠道外排;③溶解度小;④生物利用度低。实际应用中, 属于第Ⅱ类、第Ⅳ类的脂溶性或水溶性差的药物制备成 的情况较多。SMEDDS可作为疏水性、难吸收、易水解药物的载体,口服后与胃肠液接触形成载药小乳滴,增加了药物表面积和溶解度,在胃肠道均匀、快速分布,表面活性剂可降低表面张力,克服了大分子通过胃肠道上皮细胞膜时的障碍,药物易于通过胃肠壁水化层传递到吸收部位, 提高了溶出度和渗透率,降低药- 时曲线的峰 / 谷比和不良反应。SMEDDS 也可经淋巴管吸收克服首过效应,一定程度上可避免药物在胃肠道内被酶水解,有助于提高生物利用度[9]。
2主题
2.1银杏内酯自微乳的制备
组成SMEDDS的辅料对药物必须具有足够大的溶解能力。因此，一般SMEDDS处方筛选的第一步是测定药物在各种油、乳化剂或助乳化剂中的饱和溶解度， 从中选择溶解能力强的赋形剂。将过量的银杏内酯分别投入适量的油相、乳化剂和助乳化剂中,(370.5)℃搅拌 48 h 后,10000 rmin-1离心10min ,取上清液,经 0.45μm有机滤膜过滤后,用流动相稀释,并且按照比例加入内标后用 HPLC-ESI-MS测定银杏内酯的含量,根据结果得出溶解度最高的SMEDDS配方。
2.2银杏内酯自微乳的制剂评价
（1）影响自乳化效率因素的初步考察
影响自乳化制剂自微乳化速率的因素通常包括: 药物的含量、温度、稀释倍数、分散介质和胃肠道的脂解作用等。
本实验初步考察了药物含量和分散介质的影响：选择一个比较理想的空白微乳处方,在此基础上考察不同载药量和乳化介质(H2和0.1molL-1HCl)对SMEDDS自乳化时间和粒径的影响,确定最大载药量量。
（2）外观、形态与粒径分布
称取处方量的总表面活性剂,超声混合均匀,加入处方量的银杏内酯 ,振荡至药物完全溶解,再与适量的油酸乙酯混匀,制备载药自微乳,肉眼观察其外观。
取制备好的药剂适量, 37℃条件下用0.1molL-1HCl稀释100倍,取适量滴加到载有 Formvar支持膜的铜网上,自然晾干。将铜网置于蜡板上,取 2%磷钨酸( pH7.4) 1滴滴在蜡板上,将晾干的铜网倒覆于染液上,负染 15 min ,然后用蒸馏水冲洗、吸干,上透射电镜观察。
取同一样品,经激光粒度分析仪分别测量空白自微乳和载药自微乳的粒径。
（3）稳定性
稳定性的初步考察
取适量制剂加入37℃ 0.1mol L-1HCl,稀释 100倍,考察制剂自微乳化时间、粒径、成乳后稳定性。一般情况下药物在胃肠道内的滞留时间为8～24h,故所制备的微乳应至少在8h内稳定才能满足胃肠道内的吸收要求。
稳定性的测定方法
分别于0,1,2，4,8h取适量上述加0.1molL-1HCl 制备的微乳,4000rmin-1离心15mi n，取适量上清液,经流动相稀释定容后,用HPLC-ESI-MS测定。以B=Ct/C0100%作为考察稳定性程度的指标。
(4) Zeta电位
Zeta电位又叫电动电位或电动电势（ζ-电位或ζ-电势），是指剪切面(Shear Plane)的电位，是表征胶体分散系稳定性的重要指标。目前测量Zeta 电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声波法,其中以电泳法应用最广。Zeta电位与体系稳定性之间的大致关系如下表所示。
Zeta电位与体系稳定性之间的大致关系
Zeta电位[mV] | 0到5 | 10 到30 | 30到40 | 40到60 | 超过61 | |
胶体稳定性 | 快速凝结或凝聚 | 开始变得不稳定 | 稳定性一般 | 较好的稳定性 | 稳定性极好 | |
（5）载药量
制备6批银杏内酯组分自微乳制剂采用HPLC 进行测定。计算银杏内酯组分平均质量分数。
2.3银杏内酯自微乳的药效学评价[10]
（1）溶血性考察
取新鲜兔血10mL，制备红细胞混悬液，用玻璃棒搅拌10min除去纤维蛋白。加入10倍量生理盐水进行洗涤，离心(10min，1500r*min－1)至上清液澄清。取沉淀红细胞2mL，加生理盐水至100mL，4℃冷藏备用。取洁净试管7支，1～5号管为供试品，按下表依次加入2%兔红细胞混悬液、银杏内酯组分自微乳制剂、生理盐水，6号管为阴性对照，7号管为阳性对照。混匀1～7号管，置(370.5)℃恒温水浴箱中孵育，3h后观察溶血现象，判断是否溶血。
银杏内酯组分自微乳药物传递系统注射剂溶血试验
No. | 红细胞混悬液/mL | 银杏内酯组分自微乳/mL | 蒸馏水/mL | 生理盐水/mL |
1 | 2.5 | 0.1 | 0 | 2.4 |
2 | 2.5 | 0.2 | 0 | 2.3 |
3 | 2.5 | 0.3 | 0 | 2.2 |
4 | 2.5 | 0.4 | 0 | 2.1 |
5 | 2.5 | 0.5 | 0 | 2 |
6 | 2.5 | 0 | 0 | 2.5 |
7 | 2.5 | 0 | 2.5 | 0 |
（2）血管刺激性试验
取健康 耳缘无损伤的家兔4只(2.0～2. 5kg)，随机分为A(空白纳米乳)，B(生理盐水)，C(0.8g*L－1银杏内酯组分自微乳药物)，D(0.8g*L－1原料药)组，按1.0mL*kg－1耳缘静脉注射给药，连续给药5d，1次/d，末次给药24h后处死家兔，将兔耳缘沿近心端剪下，观察病理切片。
（3）急性毒性试验
选用16只昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为50，40，30，20mg*kg－14个剂量组。尾静脉给药后观察7d，得出结果。
若小鼠全部存活，未找出小鼠100%死亡的剂量，无法测出本品的 LD50，则进行最大给药量试验。
取健康小鼠40只，随机分为2组，每组雌雄各半，注射组尾静脉注射银杏内酯组分自微乳制剂，对照组注射等量生理盐水。给药后常规饲养观察7d，第8天称重后剖检观察小鼠实质性脏器有无明显病理变化， 测定脏器质量并计算脏器指数，得出结果。
3总结
SMEDDS能显著提高难溶性药物的生物利用度且制备简便,易于工业生产,己受到广泛关注。随着对高效低毒、无刺激性、生物相容性好的乳化的深入研究和对SMEDDS 释药行为的进一步探讨，将会更好地推进 SMEDDS的创新开发。
银杏内酯制成自微乳化制剂后不仅提高了药物的溶解性,而且在体内可以自发形成 O/W型的微乳,乳滴中的脂质成分使其可以通过肠道淋巴管吸收,避免了肝脏的首过效应,从而最终提高了药物的生物利用度。与普通的乳剂相比 S ME D D S 制备工艺比较简单,可以填充到软胶囊或硬胶囊中,同时具有易于保存、稳定、可以过滤除菌、吸收迅速和靶向给药等优势,作为口服药物患者的依从性好,所以有广阔的开发前景。
4参考文献
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[3]Constantinides PP. Lipid microemulsions for improving drug dissolution and oral absorption: physical and biopharmaceutical aspects[J].Pharm Res, 1995,12（11）：1561-1572.
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[6] 沈海蓉,李中东,钟明康. 自微乳释药系统及其制剂的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2005，24（5）：409.
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[8]Kohli K,Chopra S,Dhar D,et al.Self-emulsifying drug delivery systems:an approach to enhance oral bioavailability[J].Drug Discov Today,2010,15(21-22):958-965.
[9] CONSTANTINIDES PP . Lipid microemulsions for improving drug dissolution and oral absorption : physical and biopharmaceutical aspects[ J ] .Pharm Res , 1995, 12 ( 11) : 1561-1572.
[10]杨鹏飞，丁兰萍，蔡晓蕾，鲁传华，陈卫东. 银杏内酯 B 自微乳的处方优选及质量、安全性评价[J].中国实验方剂学杂志，2013,19（12）：28-33.
3. 设计方案和技术路线
研究方案：
银杏内酯组分自微乳制备处方筛选，得出最优制备方法。
对银杏内酯组分自微乳进行质量和体外释药等评价。
4. 工作计划
研究方案：
银杏内酯组分自微乳制备处方筛选，得出最优制备方法。
对银杏内酯组分自微乳进行质量和体外释药等评价。
5. 难点与创新点
提出以组分为研究对象。组分中药就是在中药药效组分理论指导下，在传统经方、验方基础上研发组分中药新药。组分中药的药效组分暨标准物质清楚、在疗效上与传统中药的疗效一致或更显著，质量可控。组分中药的特点：1 源于中药高于中药。2 药效组分暨标准物质准确。3 质量可控。4 质量标准是临床疗效的表述，包括有效性、安全性和稳定性3项指标。5 使用剂量小。6 是中医药基本理论的延伸产物，有原创性的科学理论中药药效组分理论为指导。7 引导中药科学发展方向。
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