螺旋藻中β-胡萝卜素的含量测定方法开题报告

1. 研究目的与意义

本课题的任务主要是研究螺旋藻中β-胡萝卜素的含量测定方法的对比与选择。结合所学的分析化学的基本理论，通过对常见的β-胡萝卜素含量测定方法的对比研究，分析其优缺点，选择较好的含量测定方法。

通过本毕业论文，使学生全面系统地了解螺旋藻中的成分类型、β-胡萝卜素的理化性质，通过对比不同含量测定方法，提出有一定实用价值的选择参考。从而达到锻炼学生运用所学知识分析问题和解决问题的能力，以及培养综合运用科学的技术与方法从事一定科学研究的能力的目的。

2. 文献综述

螺旋藻含有丰富生物活性物质，具有提高人体免疫功能、抗肿瘤、恢复造血机能、降脂降压、抗疲劳、和抗氧化等作用，是天然的保健食品和药源食物。我国于1935年首次在青岛发现螺旋藻，但到20世纪70年代才开始进行食用开发研究。因其营养丰富，利用价值高，逐渐成为国内外研究与开发的热点， 国内已先后研制了以螺旋藻为原料的抗辐射、抗氧化、抗肿瘤和抗衰老等药品。[1]β-胡萝卜素作为螺旋藻中的一类组成物质，国内外大量研究证实β-胡萝卜素具有抵抗某些化学物质致癌的作用，能够抑制肿瘤形成，与螺旋藻的抗辐射、抗肿瘤活性相关。

目前， 国家颁布的与食用螺旋藻产品有关的标准为GB /T 16919-1997《食用螺旋藻粉》（如表5所示）[2]。可以看出，除了一些有害物限制性指标外，标准中关于螺旋藻的成分指标物质为蛋白质与类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素是类胡萝卜素的主要组成成分之一。根据相关研究显示，市面上流通的螺旋藻中β胡萝卜素含量在1.5~6.0g/kg之间。

因此，通过β-胡萝卜素的含量检验，可以快捷、有效地对螺旋藻进行质量控制，尤其是有效成分监测上更为有效。

5 ：GB/T 169191997《食用螺旋藻粉》 技术指标

1.β-胡萝卜素的理化性质

β-胡萝卜素是橘黄色脂溶性化合物，熔点180℃左右，轻微异臭或异味，遇氧、热和光时呈不稳定，在弱碱下较稳定[3]。由于它的脂溶性以及其不稳定性，在样品及对照品处理时，不仅需要考虑溶剂的选择，其他的因素诸如温度，时间也需要进行控制。

参考β-胡萝卜素的提取技术，主要有有机溶剂提取、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法和酶反应法。常见用于提取的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、石油醚和己烷等。梁静娟通过对比甲醇、丙酮以及甲醇-丙酮混合溶液对螺旋藻中β-胡萝卜素及其他色素的提取实验[4]，结果发现甲醇有利 于β-胡萝卜素以外的其它色素的抽提，而丙酮则有利于β-胡萝卜素的提取。当 这两种溶剂单独使用时，提取效果均不理想，主要是抽提时间长，一般在5h以上，而且色素抽提不彻底。当两者结合起来进行提取时，由于两者的协同作用，抽提效果非常好。

β-胡萝卜素易被氧化，见光易分解，故含量测定时操作须在遮光条件下进行。样品在提取过程中需在遮光条件进行，减少β-胡萝卜素的损失， 从而提高了β-胡萝卜素的测定含量[8]。

另外，螺旋藻样品的处理还应经过皂化（皂化反应通常指的是碱，通常为强碱，和酯反应而生产出醇和羧酸盐，尤指油脂和碱反应）的过程，加碱除去其中的酯类物质，并且使β-胡萝卜素保持在一个稳定的弱碱性环境中。[5-10]

2.β-胡萝卜素的含量测定方法

目前常用的测定β-胡萝卜素含量的方法有纸层析法、分光光度法和高效液相色谱法。

(1)分光光度法

通过制定β-胡萝卜素标准品不同浓度与吸光度线性关系曲线（标准曲线），相同操作环境下测定样品的吸光度，扣除空白试剂，从而在标准曲线上找到吸光度对应的浓度值，即为样品中所含β-胡萝卜素的含量。

通过查阅文献可知，分光光度法测定β-胡萝卜素灵敏度高、重复性好，但其专属性较弱，若直接对样品进行测量，其吸光度值偏高，叶绿素、叶黄素等色素会产生干扰性[5]。

(2)纸层析法与薄层层析法

纸层析与薄层层析都是对样品进行纯化处理后测定其吸光度，从而得出样品含量。纸层析与薄层层析原理与柱层析相似，根据不同极性的物质在固定相与流动相分离度的差异，剪取β-胡萝卜素的色带，进行含量测定。查阅文献可知，两种分离方法都能很好地对色素进行分离[5]，其中纸层析的方法重复性更好，准确度高，且操作成本低。由此可见，纸层析法可用于样品的纯化处理。

(3)高效液相色谱法

高效液相色谱法是目前最常用的β-胡萝卜素含量测定方法，其具有准确度高、快速、简便的优点。高效液相色谱法虽然精度高，但其样品纯化处理是整个实验最重要的部分。

罗光宏研究尝试以碱液皂化、超声、冷浸方法进行提取，以正己烷、丙酮、乙醇、甲苯作为提取溶剂，提取β-胡萝卜素。研究中得出结论：螺旋藻细胞壁在匀浆或研磨过程中不易完全破坏，可能使胡萝卜素无法完全释放，同时，螺旋藻含有一定脂质成分，如果不进行皂化，会出现提取不完全和乳化现象，浓缩时残留脂质，使定容体积不准确；用乙醚萃取后蒸干溶剂、加甲醇溶解后进样的方法进行测定，可有效分离出β-胡萝卜素，减少了部分非测定物质的干扰，测定结果准确、方法专属性强、相关性好，可作为螺旋藻的质量控制方法[6]。咸瑞卿等人通过正交试验优化出从样品提取β-胡萝卜素的最佳工艺条件为：以正庚烷∶丙酮∶无水乙醇∶甲苯（10∶7∶6∶7）混合溶剂为提取剂，提取剂体积为30 mL，35℃下浸提12 h[8]。

赵厚明等人则在高效液相色谱方法选择上进行研究，其实验中优选以YMC -pack ODS(4.6mmi.d150 mm, 5μm) 色谱柱，流动相为甲醇:乙腈:二氯甲烷(60: 30:10)，在435 nm波长处检测。研究结果表明β-胡萝卜素的检测限为20ng，线性范围在4. 60~36. 80 mg/ L，相关系数为0. 9996，加样平均回收率为96. 61%。 方法准确、简便、快速，适用于螺旋藻及螺旋藻制品中β-胡萝卜素组分的检测。

国家标准GB5009.83中β-胡萝卜素的含量测定方法是高效液相色谱法。其操作步骤分为以下几个步骤，首先以石油醚 丙酮溶液提取样品后，再以氧化铝柱层析纯化、微孔滤膜过滤后进行含量测定。高效液相色谱法的色谱条件为C18色谱柱，流动相甲醇 乙腈，检测波长448nm。国标中β-胡萝卜素的含量测定方法在实行过程中需要考虑到样品提取完全性、保留时间等问题。结合以上文献的研究思路，在处理样品过程中需控制温度、光照等条件以防β-胡萝卜素的氧化，且需对样品进行皂化处理。因此，本课题将针对螺旋藻及其制品中β-胡萝卜素的检测方法作进一步研究，以确保产品中β-胡萝卜素的含量检测的准确性。

参考文献

[1]王梅，浅谈螺旋藻的营养保健功能[J]，百家论剑，2013，23：494

[2]王文博，孙建光，徐晶，螺旋藻产品活性物质检测与免疫功能研究，中国饰品卫生杂志[J]，2011，23(1)：54-61

[3]刘洪岩，β-胡萝卜素的研究进展，盐业与化工[J]，2013，42（1）：18-20

[4]梁静娟，螺旋藻β-胡萝卜素的分离提纯研究，工业微生物[J]，1997，27（2）：21-24

[5]朱秀灵，车振明，唐洁，代娟，几种β-胡 萝卜素测定方法比较研究，食品研究与开发[J]，2014，25(5)：126-128

[6]罗光宏，王勤，袁小龙，祖廷勋，RP-HPLC法测定螺旋藻中β-胡萝卜素的含量，食品科学[J]，2013：243-245

[7]咸瑞卿，李启艳，刁飞燕，王小兵，胡德福，快速溶剂萃取-超高效液相色谱法测定螺旋藻中β-胡萝卜素的含量，现代食品科技[J]，2014，30(3)：239-243

[8]赵楠，李勇勇，邵明飞，郁章玉，秦松，螺旋藻粉β-胡萝卜素含量测定方法的优化，菏泽学院学报[J]，2012，34(5)：30-34

[9]赵厚民，徐慧, 周小平，螺旋藻中β-胡萝卜素高效液相色谱测定方法的研究，中国野生植物资源[J]，2005，24(3)：43-45

[10]隋晓，盐藻中β-胡萝卜素及多糖的研究[D]，中国海洋大学，2005

3. 设计方案和技术路线

1.查阅文献，参照国标方案进行实验，并针对产品特性进行改进

2 以三氯甲烷溶解β-胡萝卜素标准品，再以石油醚定容，制成标准溶液

3.以同种方法溶解杂质色素（如α-胡萝卜素）标品，制成标准溶液

4. 工作计划

3.4-3.8 查阅并整理文献资料

3.9-3.13 完成开题报告

3.16-5.31 进行课题实验

5. 难点与创新点

我国于1935年首次在青岛发现螺旋藻，但到 20 世纪 70 年代才开始进行食用开发研究，目前国家颁布的与食用螺旋藻产品有关的标准为GB /T 16919-1997《食用螺旋藻粉》，其中除了一些有害物限制性指标外，标准中关于螺旋藻的成分指标物质为蛋白质与类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素是类胡萝卜素的主要组成成分之一。本实验通过针对螺旋藻中β-胡萝卜素的含量测定，将类胡萝卜素细化至β-胡萝卜素的含量测定上，更便于地对螺旋藻进行质量控制，尤其是有效成分监测上更为有效

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