1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
/1.研究意义
多糖是普遍存在于自然界中的由许多相同或不同的单糖通过糖苷键连接在一起的多聚化合物,是维持生命活动正常运转的基本物质之一。根据单糖的组成可分为同多糖和杂多糖[1]。同多糖指由相同单糖构成的多糖,如淀粉、纤维素等;杂多糖由不同的单糖组成,结构上还可能与蛋白质或者核酸等结合形成结合型多糖。多糖广泛存在于植物、微生物(细菌和真菌)和海藻中,来源很广,其中研究较多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖,它在医学上主要用于疫苗。在多糖的研究中,有关真菌多糖的研究比较深入,如酵母菌多糖、食用菌多糖 [2]。近年来,植物多糖的开发也日益受到人们的青睐。
植物多糖是多糖的重要组成部分，是广泛存在于植物根茎叶中的一种生物大分子，是由多个单糖分子通过糖苷键聚合、脱水形成的含酮基或醛基的多羟基聚合物[3]。植物多糖在早期的天然产物化学研究中,因活性不明显,常作为无效成分弃去。由于生物学、化学等学科的飞速发展,自20世纪80年代来,人们对植物多糖的结构、功能和生物活性有了新的认识。已有的研究发现，植物多糖对提高植物的抗旱、耐盐等抗逆生理具有重要的意义，同时具备抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗补体等功效,且毒副作用低,是目前研究的热点。
海滨锦葵（Kosteleztkya virginica）是锦葵科锦葵属多年生宿根盐生草本植物，具有庞大的肉质块根，天然分布于美国东部沿海从特拉华州至德克萨斯州的盐沼海岸带，对盐生生境的适应以拒盐为主，同时也能聚盐，经多年耐盐驯化，现可在5-15的盐水浓度中生长。1992年作为开发利用盐碱滩涂的候选物种之一，由南京大学从美国引人中国。多年的实验结果表明，海滨锦葵在我国沿海滩涂能正常生长结实，是适宜在我国海滨地区生长、优良的滩涂开发利用植物，因其种子含油量较高（19%），是目前我国生产生物柴油的理想物种之一[4～5]。此外，我们在对海滨锦葵的综合利用研究时发现，海滨锦葵块根可溶性多糖含量较高（约为2～4%），小鼠脾脏和胸腺免疫细胞增值试验（MTT法）和黄鳝免疫细胞试验对其生物活性的测定结果初步确定，海滨锦葵多糖浓度大于20μg/ml时，免疫效果显著，表明海滨锦葵多糖有望开发成为具有保健功能的食品或饲料添加剂。然而，目前关于海滨锦葵多糖在植物内的分布和结构相关研究较少，而多糖的生物活性常常取决于其一级结构和高级结构[6]。通常耐盐植物由于其耐盐机制不同，盐胁迫条件下植物体内的渗透调节物质在植物体内的分布亦不同[7]。而海滨锦葵多糖物质在植物体内的产生与积累机制至今尚未见报道。
2.国内外研究概况
2.1 植物多糖的提取、分离和纯化方法
大多数植物多糖是极性大分子化合物，通常用水、盐或稀碱、稀酸溶液在不同温度下提取。采用不同溶剂提取的多糖成分不同，其生物活性也有较大差异。范荣车等比较了3种溶剂提取的五味子多糖的抗氧化和抑菌作用，发现醇碱法提取多糖的抗氧化效果优于水提法和碱水法，而抑菌效果没有明显差异。目前提取多糖最常用的方法是热水提取或水煎煮。热水提取方法简便，通常以多糖得率及多糖相对含量为指标，选择温度、时间、提取次数和料液比等因素进行优化设计，得出最佳提取工艺条件。随着现代科学技术的发展，植物多糖的提取方法和技术也在不断改进与创新，相继建立了复合酶提取法、微波提取法、超声波提取法等新技术。与传统方法相比，用这些新技术提取植物多糖具有产率高、纯度高、效率高、物耗能耗少等特点，有着广阔的应用前景。不同提取方法对多糖的结构与活性有一定影响。柳红等研究发现，热水提取的南瓜多糖对羟基自由基的清除作用显著高于超声波提取的南瓜多糖。此外，在提取植物多糖时，应当根据不同植物多糖的特点、物理化学性质等，选取最佳提取方法和工艺条件，以提高多糖得率。杨翠娴等应用微波前处理与热水浸提工艺提取龙眼多糖，短时高频微波前处理使龙眼果肉细胞破裂，再通过后续热水浸提促进了龙眼多糖的充分溶解，从而提高了多糖的得率。
2.2 多糖在植物抗旱、耐盐胁迫方面的作用及相关机理
研究表明，干旱胁迫使植物体内碳水化合物的代谢相应发生变化，总的趋势皆为淀粉的积累下降，而积累的可溶性糖增多，并伴有有机酸、多元醇、甜菜碱、游离氨基酸和K 、C1-、Na 、N认一等矿质元素的变化，从而维持水分胁迫下植物生长发育所需的细胞膨压，减轻胁迫对植物的伤害[8]。干旱胁迫引起果树叶片某些可溶性糖含量增加，其可能原因一是淀粉等糖类主动水解;二是水分胁迫造成伤害而使光合产物不能被植物正常利用，产生可溶性糖积累，并随着水分胁迫程度的增加而进一步积累[9～10]。
有研究发现，枸杞植株在受到盐胁迫后，为适应盐溃环境，叶细胞伸展蛋白合成强度增大，且由单体聚合成多聚体二使细胞壁结构更加致密，以适应盐渍环境；盐胁迫对糖蛋白层的诱导在一定范围内随着盐浓度的增加和作用时间的延长而加强、增厚：盐浓度超过一定的极限时，糖蛋白合成强度减弱，大部分脱落，糖蛋白层变薄。新的糖蛋白合成与积累是基因表达调控的产物，它在枸杞的耐盐生理中可能起着重要的作用。也可能是一种对盐胁迫的保
护性反应，使细胞的游离表面更加牢固，减轻对细胞的损伤[11]。即盐胁迫使枸杞叶片细胞壁
2.3 植物多糖对动物免疫功能的影响
大量研究表明，植物多糖来源广泛，天然无毒，成本低廉，无药物残留，且效果持久，具备各种活性功能，能够调节机体的免疫系统，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗溃疡、抗肿瘤、降低血糖、提高消化功能等作用，是一种很有前途的可以替代抗生素的天然绿色饲料添加剂。
一些研究发现，高等植物多糖的抗肿瘤抑制活性与其结构之间的关系研究并不与以上结论相符。付平平等〔13〕将人参根多糖进一步分离得到三种多糖,其中一种具有抗肿瘤活性,但其分子量只有2.5万；陈海生等〔14〕从商陆中分离出商陆多糖I(phy-tolacca acinosa p I),分子量只有1万,结构是α(1→4)甙键连接的半乳糖醛酸聚糖,无侧链。实验结果表明,商陆多糖I 20 mg/kg时,对Meth A实体瘤,S-180实体瘤和腹水瘤都有抑制作用。此外,有人从栀子多糖中分离出5种成分,其中2种分子量分别为1.4万和1万,体外试验表明其对S-180和肝癌细胞都有抑制作用。
对中药枸杞多糖(lycicum barbarump),地黄多糖b(rehamnnia giutiinosa p b),牛膝多糖(achyranthes bidentata p),红毛五加多糖,红景天多糖(rhodioa roseal p),绞股蓝多糖,半枝莲多糖等高等植物多糖的抗肿瘤作用进行了研究,发现它们都具有抗肿瘤作用,抑瘤率或生命延长率在39%~55%之间。但由于缺少这些多糖结构的报道,因此目前尚不能探讨出高等植物多糖抗肿瘤作用的构效关系。但现已肯定的是,多糖的高级结构对功能的影响比一级结构更为重要〔15〕。因而,对多糖的结构特别是高级结构的研究是今后的重要研究方向。
综上所述，本项目将在已有的研究基础上，通过砂培试验，设置不同盐浓度梯度，跟踪监测海滨锦葵多糖在不同盐浓度下植株体内不同器官保水性能、矿质元素积累与多糖的分布和结构的变化与盐浓度的相关性，探讨多糖物质积累在海滨锦葵抗盐中的生态学意义，为海滨锦葵多糖的综合开发利用提供理论依据。
参考文献
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[15] 田庚元,冯宇澄,林颖等植物多糖的研究进展中国中药杂志,1995; 20 (7): 441
3.应用前景
本研究通过确定盐胁迫下海滨锦葵多糖在植株中的含量、分布及结构变化，可为海滨锦葵多糖的生物活性和构效关系研究提供研究基础，指导其在食品或饲料添加剂开发中的应用，并为海滨锦葵的综合开发利用提供参考依据。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
目标：
采用砂培试验，研究不同盐浓度下盐生植物海滨锦葵植株不同器官（叶片、叶柄、茎、茎基和块根）的多糖的分布与结构的变化，探讨盐胁迫条件下，海滨锦葵多糖在植株内不同器官产生与积累规律及其对植株抗盐的生态学意义，为海滨锦葵多糖的生物活性和构效关系的研究提供理论基础。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
测试项目 | 测试方法 |
多糖萃取 | 超声波辅助结合正交试验筛选最佳水浸醇沉条件 |
非多糖组分去除 | Sevag法 |
多糖纯化 | DEAT-纤维素、Sephadex G-200凝胶柱层析 |
多糖含量 | DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法与苯酚-硫酸法相结合测定 |
多糖官能团 | 傅立叶红外光谱仪测定 |
多糖糖基组分 | GC-MS（高效气相色谱-质谱）联用技术 |
技术路线：
海滨锦葵种子的收集 |
砂培，Hoagland营养液浇灌 |
植株第8片真叶长出后，4种盐浓度处理 |
不同盐浓度下海滨锦葵植株各器官多糖的提取、纯化 |
盐胁迫下海滨锦葵各器官多糖含量及结构分析及其对植株抗盐的生态学意义 |
实验方案：
（1）实验设计
采用砂培育苗（Hoagland营养液浇灌），海滨锦葵第8片真叶长出后（约30天），根据海滨锦葵耐盐状况，试验设4个盐浓度水平（按含盐量掺入Hoagland营养液后浇灌）。每处理重复3次。于海滨锦葵幼苗盐梯度处理20天、40天、60天后，分别采样并进行相关参数的测定。
（2）各器官多糖含量与结构的监测
各时期在每盆中分别选取3株代表性较好、长势相似的植株，将各植株叶片、叶柄、茎基和块根分开烘干后称量，取样，超声波破碎细胞，水浸醇沉萃取多糖，Sevag法去除非多糖组分，DEAT-纤维素和Sephadex G-200凝胶柱层析法纯化多糖后，苯酚-硫酸法测定多糖
可行性分析：
本人通过多年的系统学习，已具备草业科学相关研究的基础理论及实验操作能力；海滨锦葵萃取多糖去除色素时，其实验方法和技术都是化学实验中常用的研究方法；指导老师多年来一直从事牧草逆境生理生态的研究，积累了丰富的经验。本实验的研究人员及技术完全可行。
4. 研究创新点
特色及创新之处：
目前关于盐胁迫对不同时期海滨锦葵的多糖分布及积累的影响及其机制的相关研究资料较少，本课题通过不同时期不同盐浓度下海滨锦葵多糖分布与积累的变化，探讨不同时期不同盐浓度下海滨锦葵对盐浓度的适应机制及规律，研究结果可充实该领域研究理论，并可以得到海滨锦葵的最佳盐胁迫浓度，为得到最多的多糖。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展:
2014.11～12
（1） 收集不同生育期和不同盐浓度处理的海滨锦葵各器官的样品；
（2） 将样品烘干并称重；
（3） Sevag法去除非多糖组分，提纯多糖；
2015.1～3
（1） 不同生育期各器官多糖的含量测定；
（2） 多糖的结构分析。
2015.4～5
（1） 数据统计与分析；
（2） 撰写毕业论文，参加毕业论文答辩。
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