1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）
老鸦瓣Tulipa edulis ( Miq. ) Baker 为百合科郁金香属植物，分布于辽宁、山东、江苏、浙江、安徽、江西、湖北、湖南和陕西等地，生山坡草地及路旁，朝鲜、日本也有分布[1]。中药材光慈姑为其去掉膜质皮和柔毛后的干燥鳞茎，具有解毒散结，行血化瘀的功效，主治咽喉肿痛，瘰疬，痈疽，疮肿，产后瘀滞[2]。近年来发现光慈姑在乳腺疾病等方面治疗效果显著，因此对光慈姑的需求量不断增加，而目前光慈姑主要来源于野生，导致其供需矛盾日益突出，提高老鸦瓣产量成为亟待解决的问题[3]。老鸦瓣叶片数目随生长年限增加呈先单叶后双叶变化，双叶老鸦瓣才能进行有性生殖; 生长期短，自11 月中旬叶长出地面至翌年4 月下旬果实成熟仅100 d 左右，与郁金香、浙贝母、川贝母等同科药用植物生物学特性较相似[4]。种球生理休眠的解除通常需经低温处理，正如郁金香一样，老鸦瓣也是属于需接受一定时间的低温后，其花茎才能得到充分生长开花的鳞茎植物。
现今，仍未有老鸦瓣鳞茎低温贮藏的实验以及对老鸦瓣在冷藏过程中还原糖、蛋白质含量变化的研究。但对于鳞茎植物从郁金香(Tulipa )、百合(Lilium) 等观赏植物到贝母(Frittilaria ) 及洋葱(Alium )等药用植物在休眠过程中的生理生化研究具有一定基础，可以为老鸦瓣的研究提供指导。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1、研究目标
① 研究冷藏过程中老鸦瓣鳞茎的还原糖、可溶性蛋白代谢和淀粉酶活性变化，掌握其代谢规律；
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1、研究方法
还原糖测定采用3,5－二硝基水杨酸法；
可溶性蛋白测定采用可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色法；
淀粉酶活性测定采用3,5－二硝基水杨酸法。
2、技术路线
探讨、得出结论 |
对比、制表、分析 |
3,5－二硝基水杨酸法 |
考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色法 |
3,5－二硝基水杨酸法 |
测定还原糖含量 |
测定可溶性蛋白含量 |
测定淀粉酶活性 |
室温 冷藏 |
３、实验方案
3.1 DNS法测定还原糖含量
（一）试剂和器材
1、试剂
（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。
（2）3,5二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。
（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
（5）0.1% 酚酞指示剂。
（6）6 mol/L HCl溶液
2、材料
老鸦瓣鳞茎
3、器材
分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。
（二）操作方法
1、葡萄糖标准曲线制作
取8支15mm180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
表1-1 配制葡萄糖标准液
试剂 | 管号 | ||||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
葡萄糖标准液(ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 | 1.6 |
蒸馏水(ml) | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 |
水杨酸溶液(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
葡萄糖含量(mg) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 | 1.6 |
将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。 | |||||||||
λ=540nm处测定A |
以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品中还原糖的提取
准确称取 0.5g老鸦瓣鳞茎，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃ 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
3、样品中含糖量的测定
表1-2 测定样品中的含糖量
试剂 | 空白 | 还原糖 | 总糖 | |
样品溶液(ml) | 0 | 1.0 | 1.0 | |
蒸馏水(ml) | 2.0 | 1.0 | 1.0 | |
水杨酸(ml) | 1.50 | 1.50 | 1.50 | |
将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。 | ||||
λ=540nm处测定吸光度 | ||||
样品溶液中还原糖 | ||||
测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。
4、结果处理
按下式计算出样品中还原糖的百分含量：
还原糖=c*VT/（m *1000）*100%
式中：c ──还原糖提取液的浓度，mg/ml；VT──还原糖提取液的总体积，ml；
m ──样品重量，g；1000──mg换算成g的系数。
3.2考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量
（一）试剂和器材
1、试剂
（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；
（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；
（3）90%乙醇；
（4）磷酸（85%，W/V）。
2、材料
老鸦瓣鳞茎
3、器材
分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；
10ml具塞刻度试管14支。
（二）操作方法
1、标准曲线的绘制
（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。
表2-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.02 | 0.4 0.6 0.04 | 0.6 0.4 0.06 | 0.8 0.2 0.08 | 1.0 0 0.10 |
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
表2-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
管 号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml） 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.2 | 0.4 0.6 0.4 | 0.6 0.4 0.6 | 0.8 0.2 0.8 | 1.0 0 1.0 |
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
3、结果计算
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=c*V / (a*W) *100%
式中: c－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V－提取液总体积（ml）；
a－测定所取提取液体积（ml）；W－取样量（g）。
3.3淀粉酶活性的测定
（一）试剂和器材
1、试剂
（1） 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）；
（2）pH5.6的柠檬缓冲液：
A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）
B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）
取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；
（3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）；
（4） 麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；
（5） 0.4M NaOH
2、材料
老鸦瓣鳞茎
3、仪器
722光栅分光光度计(编号990695)； DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) ；
离心机(TDL-40B) ； 容量瓶：50ml1，100ml1；小台秤；研钵；具塞刻度试管：15ml6；
试管：15支；烧杯 7支；移液器 3支
（二）操作方法
1、酶液的制备
称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，混匀后在室温下放置，每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/分离心20分钟，取上清液备用。
2、两种淀粉酶总活性的测定
（1）取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（稀释倍数视样品酶活性大小而定，一般为20倍）；
（2）混合均匀后，取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管；
（3）各管加入1ml稀释后的酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml；
（4） 向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，以钝化酶的活性；
（5） 将测定管和对照管置于40℃（0.5℃）恒温水浴中准确保温15min再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。
3、结果计算
淀粉酶总活性[mg/(g*min) ] = c * VS / ( 5 * W )
式中： c－查标准曲线所得每管麦芽糖含量（mg）；V－提取液总体积（ml）；
W－取样量（g）。
1、可行性分析
（1） 指导老师课题组已有老鸦瓣实验材料及相关的生理、生物学研究基础，为该项目提供了理论基础；
（2） 指导老师所在的中药材研究所可为实验提供场所和实验所需的各种实验设备。
（3） 本人已经完成三年的专业理论知识实习，如植物学、遗传学及生理生物化学等课程，并具有实验操作经验
4. 研究创新点
特色或创新之处
（1）该实验第一次对老鸦瓣鳞茎低温贮藏的实验以及对老鸦瓣在冷藏过程中还原糖、蛋白质含量变化进行详细研究；
（2）尚未有关于老鸦瓣休眠过程中的生理生化过程中的研究和理论分析。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
（1）2013年7月10月 每隔两周进行室温及冷藏条件下老鸦瓣还原糖、可溶性蛋白含量和淀粉酶活性的测定；
（2）2013年11月2014年2月 对所得数据进行分析整理，查阅文献，找出规律并得出结论；
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
