蚂蟥冬眠期间抗氧化酶活性及抗氧化酶相关基因表达的研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

1、本课题的意义

宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）隶属环节动物门（Annelida）蛭纲（Hirudinea）真蛭亚纲（Euhirdinea）无吻蛭目 （Arhynchobdellida） 黄 蛭 科（Haemopdae）金线蛭属（Whitmania）。中医药学认为，宽体金线蛭味苦咸腥、性平，有小毒，具有破血通经、逐瘀消肿之效，是《中国药典》（2015年版）收载的水蛭品种之一^[1]，是目前我国中药材水蛭的主要品种和来源。

宽体金线蛭是蛭类中个体较大、分布较广的一种。蛭体宽大，一般体长 6~13 cm，体宽 1.3~2.0 cm，体重 10~20 g，部分个体长可达 20~25 cm，重可达 30 g 以上。身体扁平，略呈纺锤形，体前后两端各有1个吸盘。背部体色一般呈黑褐色或黄褐色，腹面淡黄色。背部有细密的黄黑斑点组成的纵线5 条，中间的 1 条颜色较深且明显。腹面杂有 7 条断续的纵行不规则的茶褐色斑纹或斑点，中间 2 条较明显。宽体金线蛭共有34个体节，每节又分为几个环^[2]，雄性生殖孔在第9节，雌性生殖孔在第11节。在生殖季节环带较明显，非生殖季节环带不明显。宽体金线蛭属变温动物，水温低于10 ℃停止摄食，5 ℃以下在泥土中蛰伏越冬。水温达到 10 ℃出蜇活动，运动能力弱，水温高于13 ℃运动能力加强。15~25 ℃是其适宜生长温度，温度高于30℃时，表现烦躁不安或逃跑^[3]。

近年来，受到市场需求增加，而环境受到污染和破坏，水蛭价格不断攀升，人工养殖水蛭成为热门。在养殖过程中，宽体金线蛭冬眠则拉长了水蛭的生长周期，对生产效率有较大影响。对于其冬眠的研究能帮助人们更高效地进行水蛭的生产，除此外，也为冬眠领域的研究拓宽了领域。

2、国内外研究概况

目前为止，未见有关宽体金线蛭冬眠期间抗氧化相关研究，但是有动物休眠期间抗氧化调节的相关研究。动物休眠期间抗氧化调节的相关研究研究对象主要集中在冬眠的哺乳动物，如蝙蝠，冬眠变温动物，如中华鳖，夏眠的动物如刺参^[4-6]。

动物休眠是动物在面对极端环境时表现出的呼吸和心率减慢，体温降低，基础代谢率下降，一切生命活动降低至最低限度，仅仅依靠体内贮存的物质来维持生命的一种现象。动物休眠主要分两种情况，一种是面对冬季低温的冬眠，另一种是面对夏季高温的夏眠。冬眠（Hibernation）是指在动物遭遇恶劣环境，例如温度下降和食物匿乏等，冬眠动物会通过大幅度降低自身的体温、屯、跳、呼吸及代谢率等多方面生理指标来减少对能量消耗的需求，从而存活下来，因此动物的冬眠是它们的一种生存策略^[7]。夏眠（Aestivation）是一种需氧的代谢减退状态，通常动物为了忍耐季节性的干旱、食物的匮乏以及频繁的高温而进入夏眠，也许夏眠的最好定义就是一种逆境中的生存对策^[8]。动物抗氧化防御系统（SOD、CAT、GR、GSH-PX）在动物休眠期间，清除机体产生的超氧阴离子自由基（O₂^-）、羟自由基（OH）、过氧化氢（H₂O₂）等活性氧，及其形成的自由基，这对维持机体正常作用，防止组织发生病变具有重大作用^[9,10]。动物休眠期间，抗氧化防御系统所包含的酶的活性在不同的组织、不同冬眠阶段的活性会有变化，且变化方向和水平并不具有一致性，基因表达量也是如此^[6,9-12]。

3、应用前景

随着蚂蟥市场需求不断增加，而野生资源受到环境污染、人工大量捕捞的影响，无法满足市场的需求，人工养殖成为蚂蟥来源新趋势。在蚂蟥养殖中，越冬期间会

出现大量死亡的情况。为了减少此类情况的发生，避免损失，所以研究蚂蟥冬眠过程中抗氧化调节机制，对蚂蟥养殖中如何越冬、改良蚂蟥种质具有很重要的指导意义。

除了在蚂蟥人工养殖方面的指导作用外，冬眠机制的研究对于医学保健也有重要作用。冬眠动物在非冬眠期间对于低温的耐受程度要比非冬眠动物高，冬眠动物所显示出的对冷藏保存增加耐受力的机制及适应器官保藏的策略，对于人类器官移植的质量、存活时间和利用能力具有深远的影响。需氧生物在氧化还原及各种酶促反应、电子传递等过程中，产生大量的超氧阴离子自由基（O₂^-）、羟自由基（OH）、过氧化氢（H₂O₂）等活性氧，形成自由基，进而损伤各类生物大分子，引起生物体病变，夏眠期间抗氧化防御系统对于自由基的清除则显得尤为重要。如此一来，在抗衰老研究中，可以根据休眠期间的抗氧化机理提出相应对策，这对于治疗阿兹海默症具有重要意义，并且在开发抗衰老产品方面也具有指导意义。

主要参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中国药典（一部）[M]. 北京：化学工业出版社，

2015：83.

[2]王安纲, 王祖效. 宽体金线蛭的调查及生物学特性的观察[J]. 水生态学杂志, 2005,25(5)40-41.

[3]高明, 刘玉芝, 李双安. 宽体金线蛭的生物学特性及养殖技术[J]. 宁夏农林科技, 2012,53(7)54-55.

[4]尹秋媛. 冬眠蝙蝠脑蛋白质组学及抗氧化防御的研究[D]. 华东师范大学, 2016.

[5]Zhang W Y, Niu C J, Chen B J, et al. Antioxidantresponses in hibernating Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis hatchlings.[J].Comparative Biochemistry Physiology Part A Molecular Integrative Physiology,2016, 204.

[6]熊成香. 夏眠期间灰尖巴蜗牛能量利用对策及抗氧化水平初探[D]. 陕西师范大学, 2008.

[7] GeiserF. Hibernation.[J]. Current Biology Cb, 2013, 23(5)R188-R193.

[8] Stey K B. Life in the slow lane molecular mechanisms of estivation.[J].Comparative Biochemistry Physiology Part A Molecular Integrative Physiology,2002, 133(3)733-754.

[9]王天明, 杨红生, 苏琳. 刺参呼吸树抗氧化防御酶类基因在夏眠期的表达特征[J]. 水产学报, 2011,35(8)1172-1181.

[10]Afifi M, AlkaladiA. Antioxidant system in Uromastyx philbyi, during hibernationactivityperiods[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(9)864-868.

[11]Zhang W Y, NiuC J, Chen B J, et al. Antioxidant responses in hibernating Chinese soft-shelledturtle Pelodiscus sinensis hatchlings.[J]. Comparative Biochemistry PhysiologyPart A Molecular Integrative Physiology, 2016, 204.

[12]Bagnyukova TV, Stey K B, Lushchak V I. Induction of oxidative stress in Rana ridibunda,during recoverywinter hibernation[J]. Journal of Thermal Biology, 2003,28(1)21-28.

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1、研究方法：实验研究法和定量研究法

2、技术路线：蛋白质提取及含量测定、酶活性测定、实时荧光定量PCR

3、实验方案及可行性分析

消化道总蛋白提取：剪取经冬眠处理的蚂蟥肠道组织0.1g，加入RIPA裂解液（含PMSF，蛋白酶等）1ml，转移至玻璃匀浆器，冰上匀浆至组织块消失，注意低温，裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（一）、临苯三酚自氧化法测定SOD活性：

1、试剂 

（1）Tris-HCl缓冲液

0.1mol/l 的盐酸：取浓盐酸（密度为1.18，36）8.4ml，加双蒸水稀释至1000ml。

0.1mol/l 的Tris 溶液：取6.057 克Tris，加水溶解，配成500ml。Tris-HCl 缓冲液（pH 为8.4，浓度0.1mol/l）：取86ml 0.1mol/l 盐酸，取250ml 0.1mol/l 的Tris 溶液，加双蒸水稀释至500ml。

（2）10mmol/lHCl：取0.1mol/l 的盐酸10ml,加双蒸水稀释至100ml。

（3）6mmol/l 邻苯三酚(精确)：用10mmol/lHCl 配制。0.07567 g 100ml 10mmol/lHCl。

2、邻苯三酚自氧化速率的测定 

邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300μL Tris-HCl 缓冲液，放置酶标仪中25℃恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10μL双蒸水，在420nm处每30s测定一次吸光值，自氧化速率在3 分钟内有效。调整邻苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0.020OD/分。(注：实验时要确定邻苯三酚的用量，可先做8、9、10μL各两个)

3、酶活性测定

SOD活性测定与步骤2相同，只是将双蒸水换成同体积酶液。在420nm 下，每隔30 秒钟测吸光度值一次，计算平均每分钟的吸光度变化值△A420/分。控制SOD 样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，使邻苯三酚自氧化速率的吸光度值逐渐下降，即临苯三酚自氧化速率被抑制50左右。注：取组织匀浆时，可先做1、3、5 倍稀释管各两只，以确定稀释倍数。

（3）计算）

SOD 活力单位定义：在规定条件下，1ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚420nm下自氧化速率达50时的酶活力单位（U）或称Marklund 单位。样品液中每mg蛋白的总SOD活性单位数称为样品液的SOD 比活。

SOD活力(U/ml) (0.020-△A₄₂₀)/0.020100 /50 V_总/ （V _定义V _样）样品稀释倍数

V _总：反应总体积3（ml）

V _样：加入样品液的体积3（ml）

V _定义：酶活力单位定义体积1（ml）

（二）、CAT活性测定

1、试剂 

匀浆后用生理盐水稀释10倍，制得粗酶液。

（1）pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液：

基质液：65μmol/mL H₂O₂，以pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液稀释100mL：24.3ml

0.2mol/L Na₂HPO₄（100 mL用 1.7406g） 5.7ml 0.2mol/L NaH₂PO₄（100 mL用0.1778g）

（2）0.2mol/L Na₂HPO₄（100 mL用 1.7406g） 5.7ml 0.2mol/L NaH₂PO₄（100 mL用0.1778g） 670μl 30 H₂O₂，稀释至100 mL。

30 H₂O₂（W/V）：密度1.11g/cm³。

（3）钼酸铵：32.4mmol/L（用四水合钼酸铵1235.86，4.0042g/100mL）

2、活性测定 

试剂

测定管

标准管1

对照管

标准管2

缓冲液

-

0.1

-

0.6

基质液

0.5

0.5

0.5

-

粗酶液

0.1

-

0.1

-

钼酸铵

0.5

0.5

0.5

0.5

加入基质液后置于37℃水浴5min，加入酶液后将所加过试剂的试管在37℃水浴1min（对照管不加热），然后立即加入钼酸铵500μl，混匀10 min后在405nm处以去离子水调零比色（汲取200μl加入酶标板）。试剂液不够可根据比例适当增加1倍。

3、计算

Uc( A_对-A_测)/A_标650.5/0.1(A_对-A_测)/A_标325

65为基质液浓度，0.5为500μl基质液体积，0.1为酶液用量。

Uc单位：μmol/(minL) （每分钟分解1μmol过氧化氢为一个酶活力单位）

A_标∣A_标1- A_标2∣

（三）GR活性测定

1、试剂

（1）、50mmol/L Tris-HCl 磷酸缓冲液（含0.1mmol/LEDTA） PH7.5

（2）、5mmol/L MgCl₂

（3）、10mmol/L NADPH₂

（4）、10mmol/L SGGS

2、活性测定

取（1）和（2）预混成混合反应液，（3）和（4），25℃水浴保温

取780μL加入提取液150μL，加入20μL（3） 50μL （4）

每隔30S读取一次OD₃₄₀ ，取0.5-3.5min段数值，即3min反应时间来计算酶活性

3、酶活力的定义

在25℃条件下测定谷胱甘肽还原酶（GR）活性，每毫克蛋白扣除非酶反应后每分钟使NADPH减少1μmol/L为1个酶活力单位。

（四）、GSH-PX活性测定

1、试剂

（1）50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.4

（2）1mmol/L GSH50mL：0.0157g

（3）0.1mmol/L NADPH50mL：0.0042g

（4）2mmol/L 叠氮化钠50mL：0.0065g

（5）0.5/ mLGR50mL：取A28L。（20L GR液加磷酸缓冲液稀释至10 mL瓶中）

（6）1mmol/LEDTA50mL：0.0146g

（7）2.5mmol/L双氧水100mL：取30双氧水26L

2、活性测定 

20L酶液 160L反应体系（反应6min） 20L双氧水（迅速）。340nm，20s一次，3min。反应体系：（2）（3）（4）（5）（6）

3、酶活性定义

在37 ℃pH6.4的条件下测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性，扣除非酶反应，

1 μl酶溶液使GSH浓度下降为1 μmol个酶活力单位。

消化道总RNA提取：将蚂蟥肠道取出，加入预冷的生理盐水中洗净，无菌脱脂棉擦干，加装有液氮的研钵中，利用组织研磨棒充分研磨粉碎，将得到的蚂蟥消化道粉末加入预冷的TRIzol试剂中，摇匀常温反应3min，配平（预冷的TRIzol溶液）12000 r/min离心10 min。吸取600 μL上清液，小心不要将沉淀物吸出，加入200 μL氯仿，轻轻摇匀，配平（氯仿）12000 r/min离心10 min。吸取200 μL上清液，加入200 μL预冷异丙醇，配平（预冷的异丙醇）离心同上。弃去上清液，注意不要将RNA丢弃。75预冷酒精洗涤两次。加入20~40μL无菌水溶解RNA，-20℃保存。

RNA反转录：试剂盒SYBRGreenAssay9（①-⑨）取2 μL②号管试剂和1 μL①号管试剂，加7 μL获得的RNA样品液，混合室温反应5min。AB3反转录。4 μL④、1 μL③、1 μL⑤、4 μL⑥，AA4反转录。保存于洁净无菌管中，-20 ℃贮存。

实时荧光PCR：0.4 μL上游引物和0.4 μL下游引物（分别是SOD/CAT/UQCT/MDH/SDH）混合，加入2μL反转录得到的样品液，试剂盒中白色管和黄色管加无菌水预混，注意避光。预混液取17.2 μL加入前面的混合液中混合均匀。放入设定好的PCR仪器，95℃预变性30s，95℃变性5s，59℃退火30s，72℃延伸30s同时获取荧光，共40个循环，后行产物的溶解曲线分析, 得到样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-ΔΔCt 表示基因的相对表达量，ΔΔCt[Ct(待测基因)-Ct(β-actin)]试验组-[Ct(待测基因)-Ct(β-actin)]对照组。等待运行结果。

根据所查阅文献资料，在规范操作、妥善保存实验材料的情况下，预计该实验可行性较高。