1. 研究目的与意义
补益药是中药中药物之一，有着补益人体亏损，增强人体活动机能，提高抗病能力，消除虚弱等功效，按作用可分为补气，补血，补阴，补阳等。临床和现代药理研究表明补益药在治疗各种疾病，在神经，免疫，内分泌，代谢，抗衰老，消化，心血管方面有一定疗效。多项研究证明补益药可以抗衰老，促进身体代谢，调节中枢神经系统，提高细胞免疫能力，进而治疗阿尔茨海默症，心脑血管疾病等老年性相关疾病。抗DNA损伤作用是目前可能抗衰老的机理之一。王明艳等人开展了人参，黄芪，当归，枸杞这几味补益药在抗衰老的作用机理。该实验通过对致损组和补益药组，正常组的老鼠骨髓细胞微核率，运用统计学方法分析，结果证明这些补益药有着抗DNA损伤的作用。补益药中的微量元素具有抗氧化的作用，能够清除自由基，这又是可能抗衰老的机制之一。目前来说，没有确切可靠的实验成果来直接证明DNA损伤，自由基这些学说是否是衰老机制的一部分，有待于进一步实验研究来证明。
研究衰老机制是一个漫长艰辛的过程，耗费着大量的人力物力，实验动物的优质选择往往可以减少大量的成本和时间，秀丽隐杆线虫（C. elegans）有丰富的行为和基因易操作的特点，生长周期短，繁殖快（同一基因的纯合体），是很好的延缓衰老研究的模式生物，被大量应用于现代发育生物学，遗传学，基因组学的研究中。线虫有短期习惯性，去习惯性和敏感化的能力，与实验需要的哺乳类动物小鼠，细胞等相比，它的寿命周期短，能够在实验室重复培养，这也就意味着实验成本和时间的降低。根据大量的研究报道，补益药能对秀丽隐杆线虫的寿命有一定延长或者抑制作用，这与研究抗衰老密切相关。唐进法等用何首乌乙酸乙酯提取物EPM对线虫进行寿命观察，分别给予高（50mg/ml），中（37.5mg/l），低（25mg/l），还有空白对照组，结果显示高剂量的那组存活时间显著延长，证明了补益药在线虫上的有抗衰老作用。徐燕茹实验证明了补益药杜仲对秀丽隐杆线虫也有着抗衰老作用。所以说，补益药对秀丽隐杆抗衰老实验研究同样能都为研究衰老机制提供实验依据和成果，也能避免一些不必要在其他生物上实验研究。
对于补益药在抗衰老的研究，目前都是在果蝇，线虫等这些生物上进行，离运用到人体还有很长的时间，但这些实验将有一定的指导和研究意义等。本实验旨在对补益药在秀丽隐杆线虫上的实验研究，为补益药对抗衰老的实验和衰老机制的研究提供依据。
2. 文献综述
补益药对抗衰老的实验研究
摘要：
随着社会老龄化步伐的加快和现代化生活水平的提高，衰老和抗衰老已经成为医学生物学领域研究的热点，补益药也更多的受到人们的青睐，伴随着现代科学技术的发展，目前在细胞，分子，基因方面，取得了重大进步。本文是对补益药在抗衰老方面的实验研究作一综述，将对补益药在抗衰老方面的开发，老年疾病的预防和治疗，保健起一定的理论指导意义。
3. 设计方案和技术路线
补益药的提取参考 当归切片粉碎，75％乙醇，料液比1:9，回流3次，3h/次，70C，低于40C保存。 人参75％乙醇，料液比1:8，回流3次，第一次40min，第二次20min，第三次40min，80C趁热过滤，取滤液。 黄芪75％乙醇，料液比1:10,70C,提取时间2h，提3次。醇提后药材经处理后再用纯水以料液比 1；6,提取温度为 100C，提取时间 2 h，提取 2 次。 甘草75％乙醇，料液比1：20，回流提取时间3h，取提取液。85C。 麦冬过5-10目筛，75％乙醇10倍量，热回流3h，每次1h。 补益药浓度的参考 当归 人参 黄芪 甘草 麦冬 线虫的培养 秀丽线虫多为雌雄同体，饲养于加有大肠杆菌的培养基中，普通野生型秀丽线虫（N2，简称普通型），20℃恒温培养；AD 模型秀丽线虫（Cl4176）于 16℃恒温培养。秀丽线虫接种于已均匀涂 E.coli OP50 或药物与 E.coliOP50按1：4 比例混合后涂布于秀丽线虫培养基（Nematode Growth Medium）。 大肠杆菌培养 秀丽线虫固体培养部分使用大肠杆菌OP50，液体培养法部分大肠杆菌作为秀丽线虫的食物，大肠杆菌的制备方法如下：配制LB培养基，灭菌后倒入9cm平皿中，凝固后，从 OP50 菌板挑取单菌落至固态 LB 培养基上，37℃培养10h后从固态培养基上挑取长势较好的菌落至液态 LB 培养基中，于37 ℃ ，210 rmin-1振荡培养18h后取液，8 000rmin-1离心2 min 浓缩菌液。浓缩后菌液OD值约在0.55-0.65，大肠菌液置于1.5ml EP管中置4 ℃冰箱保存。 秀丽线虫冻存 实验室虫种的保存可以将秀丽线虫用 M9 洗净后放入 30％甘油中，于-80℃保存，该方法可保存 2 个月左右。 |
秀丽隐杆线虫的复苏 将冻存管取出，迅速融化，接种于涂布好 E. coli OP50 的NGM 培养基上，在 20℃生化培养箱中培养至成虫。 秀丽隐杆线虫的转板 当秀丽隐杆线虫培养至后期，NGM 板上 E. coli OP50 消耗将尽，并且板上秀丽隐杆线虫还未达到实验需要的时期，可以予以转板。将需要转板的 NGM 固体培养基用手术刀切割成 1cm1cm 大小的琼脂块，将琼脂块平移贴合至新的涂布好E. coli OP50的NGM固体板上，培养皿20℃培养箱中倒置过夜。待秀丽隐杆线虫从旧的琼脂块上爬下后，将旧的琼脂块从新的 NGM 培养基上取除。继续在 20℃培养箱中静置培养。 选用雌雄同体的秀丽隐杆线虫，将培养中的L4期线虫转移至已经预先涂满 OP50 的NGM 平板，于20 ℃培养箱中培养。在线虫处于产卵期时，将亲代线虫每天转移至新板，以便将亲代和子代分开，之后每天对线虫进行观察，直到线虫全部死亡。 线虫同步化 1.取培养三天的线虫，用液体NGM冲洗虫板，移至10ml离心管中，离心。 2.移除上清保留一部分加无菌水，加裂解液，室温振荡裂解，显微镜观察。 3.虫体裂解完全后离心。 4.移除上清加液体NGM冲洗。 5移除上清加S-compelet冲洗。 6.移除上清加S-compelet，摇床培养。 7.同步化后得幼虫，振荡离心管混匀，抽取一部分显微镜下观察。 线虫的寿命观测 在96孔板中进行，20C按原先设计好的补益药浓度加入，同浓度五个孔，每次固定量，低浓度到高浓度加入，无菌水将同步化的线虫到补益药中，上样当天为0天计算，一星期后，隔两天统计各孔数量，直至线虫死完。同步化的线虫转移到事先配好的培养基，里面有设计好的补益药浓度，上样当天是0天，一星期后观察，每天统计，直至线虫死完。 热休克实验 同期化的 L4 期线虫给药第 10d。每组 15 只线虫转移到空白培养基中，置于 35℃生化培养箱中培养。第 8h 和 10h 计存活数与死亡数，统计存活率。经过高温培养的线虫大部分呈僵直状态，因此需要仔细观察线虫的头部是否还会摆动，如果摆动不明显可以用挑针触碰，可以摆动的记为存活，实验重复 3 次。 |
热应激试验 挑取同步化的 L4 期秀丽线虫到培养基中，每个培养基中约有 15 条，于 20℃培养。每日挑虫转至一洁净空白培养板，48 小时后，将培养基从 20℃转至 35℃培养箱，每小时观察统计秀丽线虫死亡数，直至秀丽线虫全部死亡。重复三次。 线虫生殖力的测试 每组挑取 L4 期秀丽隐杆线虫 10 条，单独饲养，即每组 10 个平行板，此时记为生殖实验第 1 天。每 24 h 将其移至新板中，直至线虫生殖能力丧失。20℃下孵育产卵板，48 h 后计数子代数目（本实验以子代线虫数间接反映线虫的产卵数） 氧化损伤实验 同期化的 L4 期线虫给药第 10d。取一个 12 孔板，在每个孔中加入 2mL 的新鲜配制的过氧化氢溶液(为保证线虫在液体中正常存活，过氧化氢溶液用 M9 缓冲液稀释)，每组两个浓度，分别为 0.002%，0.003%。在每个小孔的过氧化氢溶液放入 15 只线虫，间隔固定时间观察线虫的存活数和死亡数，统计存活率，实验重复 3 次。 线虫运动能力测试 分别挑取 L4 期秀丽隐杆线虫至各组，每组 3 个平行板，每板 15 条。48 h 后先将线虫挑取至空白NGM 培养基上，待其运动后脱离身上粘附的 OP50，再转移至另一空白培养基，测试线虫在 20 s 内的身体弯曲次数。线虫在运动时，移动相当于身体长轴方向上的一个波长距离计为 1 次。 动态摆动频率测定 同期化的 L4 期线虫给药第 10d。取一个 12 孔板，每个孔中均加入 M9 缓冲液 2mL，每个小孔中放入 15 只线虫。放入后五分钟之内观察其身体摆动频率，即一分钟内线虫身体弯曲摆动次数(身体从一个方向弯曲到另一个方向，然后恢复原来的方向，记作一次摆动)，实验重复 3 次。 |
4. 工作计划
（一）准备阶段
1.2022.1.17-2022.3.6查阅并整理文献
2.2022.3.7-3.12完成开题报告
5. 难点与创新点
1.本课题旨在原有的补益药对抗衰老的实验研究基础上，重新对抗衰老的这一机制的进行深入研究，为补益药在临床上的发挥疗效提供依据。
2.本课题实验采取的最优制备工艺技术，对已有实验进行了改进，探讨不同的制备方法是否会影响到最终的实验结果，为将来工业化生产补益药提供实验室依据，方法合理科学，制备简单。
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