1. 研究目的与意义
内容：本课题以利用选择监控离子质谱技术SRM定量复杂的细胞裂解液中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白水平为研究内容，先建立复杂样品中多肽靶向定量的方法，再通过使用小分子调节剂调控细胞内缺氧代谢通路，改变HIF-1α的羟化水平，并利用质谱靶向羟化前后HIF-1α蛋白水平的变化。
意义：缺氧诱导因子HIF是细胞内的氧调节转录因子，HIF蛋白表达水平上调对一些缺氧相关的疾病例如局部缺血、肾性贫血等有治疗意义，而表达水平下调又可以抑制癌细胞的生长，在一定程度上抑制癌症的的发生，所以对HIF进行调控有重要的生物学意义。
但是HIF蛋白在常氧环境下会被迅速降解，HIF及其羟化后的蛋白水平很难被检测到，所以本课题拟使用脯氨酸羟化酶PHD抑制剂处理细胞，使HIF的表达水平上调而易于检测，利用选择离子质谱监控技术SRM对缺氧诱导因子HIF及其羟化后的蛋白水平进行直接定量。
2. 文献综述
利用质谱定量缺氧诱导因子HIF蛋白的研究进展摘 要缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor,HIF）是一种转录因子蛋白，普遍存在于哺乳动物细胞内，起着氧调节的作用。
HIF在缺氧环境中可以稳定存在，但在常氧环境中，HIF-1α蛋白会在脯氨酸羟化酶（Prolyl Hydroxylase,PHD）的作用下被羟化，经过泛素-蛋白酶体通路被迅速降解。
因此，通过激活或抑制PHD的活性可以对HIF的表达水平进行调控。
3. 设计方案和技术路线
设计方案：1. 细胞匀浆液中多肽的定量条件：使用玻璃匀浆器匀浆细胞后，将经有机溶剂变性的细胞裂解液与多肽反应，并利用高分辨质谱利用SRM法检测其中HIF-1α蛋白含量及其羟化后蛋白水平，确定其检测限及灵敏度。
2. 标准曲线的配制，根据检测限，配制一系列浓度的HIF-1α及其羟化的多肽底物，并与细胞匀浆液共孵育，测定线性，判断方法适用性。
3. 细胞的培养及小分子的处理：培养人肝癌细胞HepG2，在常氧或人工模拟缺氧的环境下，向细胞中处理不同时间不同剂量的HIF羟化激活剂或抑制剂，并检测小分子时间及给药剂量对细胞毒活性的影响。
4. 工作计划
2022年1月-3月12日：进行文献调研，熟悉课题内容，撰写开题报告及综述2022年3月12日~4月上旬：摸索细胞匀浆液中多肽的定量条件，配制标准曲线并判断方法的适用性，培养细胞并处理小分子2022年4月：开始制备质谱样品，利用SRM法检测HIF-1α羟化前后的含量变化2022年5月：整理数据并总结实验结果，进行毕业论文撰写2022年6月：修改毕业论文并提交
5. 难点与创新点
本方案利用选择离子监控技术SRM对缺氧诱导因子HIF蛋白进行定量。
质谱定量蛋白技术是一种直接靶向定量蛋白质的技术，SRM可以在复杂的蛋白质样品中准确地选择出特定的母离子和碰撞破碎的子离子进行筛选分析，降低质谱的噪音干扰，从而达到高灵敏度定量的目的。
常氧环境下的HIF蛋白本身在羟化后非常不稳定，所以利用传统的Western-blot技术很难准确捕捉到HIF羟化的信号，定量结果也不够准确。
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