1. 研究目的与意义
1、内容
查阅15版药典，整理了所有以多糖作为含量测定指标的中药，最终确定了药材黄精作为实验药材。
以药典的含量测定方法为依据，设置了黄精药材和黄精制剂的含量测定对照实验。如果黄精制剂的多糖检测结果大于等量黄精药材中的多糖检测结果，说明药物制剂过程中添加的辅料，如：淀粉、糊精等，会对该制剂的含量测定造成影响。
2. 文献综述
中药多糖的提取、分离纯化及分析方法研究综述
专业制药工程班级12制药作者吕可指导老师张兴德
摘要通过查阅药典和相关文献，找出中药多糖提取方法、分离方法、纯化方法以及含量测定方法的共性方法，并对于不用方法进行归纳分析。同时阐述了多糖提取分离纯化的研究进展。
关键词中药多糖；提取；分离纯化；含量测定
本综述旨在通过查阅中国知网中1990年以来的相关文献，讨论当前多糖提取、分离纯化和含量测定的不同方法，并希望找出其中的共性方法，应用在后续相关实验中。
在常用的5000多种中药中，许多中药的多糖成分发挥着至关重要的作用，例如：灵芝多糖、香菇多糖、枸杞多糖、茯苓多糖、银耳多糖等。这些多糖是中药发挥各自独特药效和治疗活性的重要组成物质。
多糖是由单糖连接而成的多聚物，尤其是中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，而且几乎没有毒性，成为当前的研究热点。因此，其相关提取、分离纯化和含量测定方法的研究有着重大意义。
1.2015版药典的研究概述
药典是一个国家药品质量规格标准的法典。药典中收载疗效确切、毒副作用小、质量稳定的常用药物及其制剂，规定其质量标准、制备要求、检验方法等，作为药物生产、检验、供应与使用的依据。
因此在查阅多糖的相关文献之前，首先查阅现行的2015版《中国药典》，了解药典中对于以多糖作为控制指标的药材的相关规定。
1.1单味药材和中药制剂
15版药典中明确规定以多糖作为控制指标的单味药材有：云芝、玉竹、灵芝、昆布、金樱子、枸杞子、铁皮石斛、海藻和黄精，中药制剂有泌石通胶囊。药典中规定的多糖含量测定方法分为4种：剩余碘量法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和3．5一二硝基水杨酸比色定糖法。
1.1.1剩余碘量法
原理：剩余碘量法是在供试品溶液中先加入定量、过量的碘滴定液，待I2与测定组分反应完全后，然后用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，以求出待测组分含量的方法。使用剩余碘量法时，用淀粉作指示剂。淀粉指示剂应在近终点时加入，因为当溶液中有大量碘存在时，碘易吸附在淀粉表面，影响终点的正确判断。
1.1.2苯酚-硫酸法
原理：糖在浓硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。在10～100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。在490nm波长左右有最大吸收峰，具体的药物规定的最大吸收峰略有差别。故可用比色法在波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法。
1.1.3蒽酮-硫酸显色法
原理：糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm左右有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定。
1.1.43.5一二硝基水杨酸比色定糖法
原理：3.5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
药典中收录的以多糖为含量测定指标的药材和制剂如下：
编号 | 药材名称 | 含量测定方法 |
1 | 云芝 | 剩余碘量法 |
2 | 玉竹、金樱子、枸杞子、铁皮石斛 | 苯酚-硫酸法 |
3 | 灵芝、昆布、海藻、黄精 | 蒽酮-硫酸法 |
4 | 泌石通胶囊 | 3.5一二硝基水杨酸比色定糖法 |
1.2分析
由于各类药材中所含糖类的性质不同，采取的测定方法也有所不同。例如，云芝多糖含有以下几种单糖:葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和木糖，除岩藻糖无还原性外，其余均有还原性，因此采用剩余碘量法检测。而苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的主要区别在于，后者不但可以用于检测戊糖和己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类；苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定。
另外，这里列出的药材和制剂均是在药典中明确规定的以多糖的含量作为该药材或制剂的质量合格与否的评价指标，并不意味着只有这几种药含有多糖成分。实际上，含有多糖成分的中药远远不止这几种，只不过因为多糖成分不是含量测定的指标或者不是主要成分，所以不在此列。
2.文献研究
在中国知网上查阅1990年至今的相关文献资料，对于已报道的单味药材的相关前处理、提取方法、分离纯化方法和含量测定方法进行了一定的整理和分析。
2.1前处理方法
前处理方法主要是为了加速多糖成分的提取，以及在提取多糖之前进行简单除杂，减少提取过程中杂质的含量。
2.1.1简单烘干粉碎
适用于菌类子实体，如白灵菇[1]、香菇和鸡腿菇[2]均是在一定温度下烘干后，进行粉碎，以便于后续的多糖提取。
2.1.2石油醚、乙醇等有机相脱脂
当样品中除了多糖还有其他的有机成分时，往往会先进行样品的有机相脱脂。脱脂的方法有简单有机萃取和有机试剂回流。萃取时将样品混悬于水中,加入石油醚等，静置一段时间，后弃去上层有机相，抽滤药材粉末，烘干待用[3]。而有机试剂回流通常采用乙醇。有的方法是在原药材中加入一定量乙醇，回流1小时后抽滤，样品烘干待用[4]。
2.2提取方法
提取方法主要有热水提取、碱提取、酸提取、盐提取、超声提取和微波辅助提取法这6种。每种方法各有各自的优缺点和适用情况，具体如下：
2.2.1热水提取
水提取是多糖提取最常用的方法，优点是成本低、提取效率高，但是不具有针对性提取物复杂多样。
2.2.2碱浸提法
此法不常用，往往是样品或药材中含有生物碱或其他杂质时，为了减少生物碱的提取造成多糖的干扰，采用添加一定浓度的氢氧化钠溶液代替水进行提取，操作过程基本同于热水浸提法，提取结束后得到的上清液需要用低浓度盐酸溶液中和,透析脱盐,再浓缩[5]。
2.2.3酸浸提法
该法同碱提取法相对应，操作过程基本和碱浸提法相同,但是提取剂采用含有一定浓度的盐酸溶液，浓度梯度分别为20、30、40g/L，提取结束后用低浓度氢氧化钠溶液中和，透析脱盐，后浓缩成一定浓度的母液待测[6]。
2.2.4盐浸提法
盐提取法可以根据所提取的多糖和药材性质的不同，采用不同的盐进行提取，而且操作基本相同，一般采用不同浓度的碳酸钠溶液，可以为20、30、40g/L,提取结束后，用盐酸溶液中和至无气泡，然后浓缩待用[7]。
2.2.5超声提取
该法是在水提取方法上增加了一段时间的超声波处理，以达到粉碎、加速提取的作用[8]。该法可以减少提取时间，同时加快提取效率，不过缺点是随着超声时间的增加，杂质的提取量也增加，因此多糖的纯度会下降[9]。
2.2.6微波辅助提取法
微波辅助提取法是一种较新的提取方法，还没有应用到工业生产中,但是在目前的研究中发现与传统的浸提法相比，它设备简单、适用范围广、提取效率高、选择性强、重现性好、节省时间、节省溶剂、加热均匀、易于控制、节能环保等优点[10]。王晓军和李颖[11]也确定了微波辅助萃取黑木耳多糖的提取工艺，即微波功率700W，微波辐射时间40s，浸提剂40m/g，水浴浸提时间4.5h，认为微波辅助提取法是提取黑木耳多糖的一种有效方法[12]。
2.2.7总结
早期的提取方法主要是水提取。酸水、碱水和盐水是在水提取的基础上进行的适当改良，因为和提取物性质、状态等多方面因素有关，提取剂的选择比较复杂，所以不常用。最近的研究进展是将超声提取、微波辅助提取等应用到工业多糖提取中，增加提取效率，减少提取时间，提取剂用量。
2.3分离纯化方法
2.3.1醇沉
该方法一般和水提取法并用，是最常见、最方便、效果良好的分离多糖的方法。提取后的浓缩液加入一定体积的乙醇，静置沉淀，抽滤取沉淀，少量乙醇洗涤后，取沉淀烘干，即为多糖成品。该实验方法往往需要对于加入乙醇浓度、乙醇体积、静置时间等条件进行相关的单因素条件分析[13]。
2.3.2吸附去色素
去色素的方法比较多，主要是利用物理吸附作用去色素。有活性炭吸附去色素[14]、大孔树脂去色素等，其中最主要的去色素方法是利用大孔树脂的离子交换作用。在此列举一个树脂出色素方法：
(1)、大孔吸附树脂的预处理
蒸馏水浸泡→95%乙醇浸泡24h→蒸馏水洗至无醇味→3%的HCl溶液浸泡12h并水洗至中性→3%的NaOH溶液浸泡12h并水洗至中性→待用
(2)、静态脱色法
通过恒温振荡的方式使树脂和待脱色多糖充分接触，反应一段时间后即可完成脱色。一般考虑树脂用量、脱色时间、振荡频率、振荡时间和温度等参数，结束后计算脱色率[15]。
2.3.3Sevag法除蛋白
考马斯亮蓝测定蛋白原理为：
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它的阴离子与蛋白质上的酰胺结合后变为蓝色，最大吸收波长由488nm移到595nm波长，吸光度值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质含量测定。
2.4含量测定
和药典中列出的四种不同的是，1990年至今的文献中，采用的多糖提取方法集中在苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法之中。这两种方法的原理都是利用糠醛的不同显色反应进行紫外-分光光度法，进行吸光度测定。不同之处在于这两种方法针对不同的糖，具体原理在（一）中已说明。
含量测定方法大致相同，概述如下：
制作标准曲线：取葡萄糖标准品→制成浓度提取→加入苯酚-硫酸试液/蒽酮-硫酸试液→沸水浴→冷却至室温→测定吸光度→绘制标准曲线
测定：取样→稀释→加苯酚-硫酸试液/蒽酮-硫酸试液→沸水浴→冷却至室温→测定吸光度→计算
计算公式如下图[16]：
2.5古今分析
近年来，植物多糖的药理作用越来越被人们所关注，但是多糖含有色素、无机盐、大分子蛋白质、木质素及醇不溶的小分子有机物等杂质，这些杂质的存在不仅影响产品质量、多糖的纯度，且阻碍了对多糖的结构和药理研究，从而导致结果出现较大差异。
所以多糖提取方法、分离方法和纯化方法越来越注重产品的纯度。提取方法从最基础、最常用热水提取，到小幅度改进的酸水、碱水、盐水提取，到高效的超声波和微波进行辅助提取逐步进化。虽然超声提取和微波辅助提取还处于实验室研究状态，但是在不久的将来应该能应用于生产。
早期纯化的方法一般是用乙醇沉淀进行初步纯化，近年来因为对于多糖成分的分析深入，和相关试验方法的深入研究，使得多糖成分的分离、纯化等方法逐渐增加。
根据不同的需要，会对相应的粗多糖进行分离、去除色素或者蛋白质。除去色素的常用方法有反复乙醇沉淀法、离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法等。脱蛋白的常用方法有Sevag法、三氯乙酸法、酶法；无机盐和小分子量的有机物则可通过透析除去。
3.总结与展望
综上所述，通过大量文献阅读研究[17]～[28]，已对多糖的提取、分离、纯化的现有方法和研究近况做了大概的整理和研究，对于后续的实验方案的确定有着重大作用。根据文献资料的研究，目前多糖的提取工艺普遍采用热水回流提取，尽管有相关的文献对于超声波辅助提取、微波辅助提取甚至超临界萃取有一定研究，但是由于经济效益的原因不能广泛应用；多糖的纯化方法也比较统一，用Sevag法除蛋白，用树脂吸附除去色素；最后，根据2015版药典，多糖的含量测定方法以苯酚-硫酸法为主，少部分文献的研究采用硫酸-蒽酮法。
通过文献的研读，对于后续的中药多糖的提取、分离、纯化的相关实验有了一定的了解，对于实验方案的制定也起到了提示性作用。
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3. 设计方案和技术路线
1、研究方案
1、中药黄精的多糖提取和含量测定
1.1多糖提取
4. 工作计划
2022.1.4-2022.1.20
查阅文献，完成一篇中药多糖提取、分离、纯化实验研究进展综述
2022.2.1-2.16.2.20
5. 难点与创新点
1、研究一种可行的排除中药辅料对于多糖测定的影响的前处理方法
2、减少多糖制剂中多糖含量测定的误差
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