1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
国内外研究概况及课题意义：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum，简称Pcc) ，为革兰氏阴性细菌[1]，是多种植物细菌性软腐病的病原菌[2]，能够在彩色马蹄莲、胡萝卜、黄瓜、辣椒、大白菜和马铃薯等寄主上引起严重的细菌性软腐病，也能引起多种水果蔬菜贮藏期腐烂[3]。
细胞壁降解酶，如果胶裂解酶、纤维素酶和蛋白酶等，被认为是Pcc 的主要致病因子。
细菌性软腐病病状随寄主和外界条件的差异而略有变化，一般来说，柔嫩多汁的组织更易受到侵染，呈水浸半透明状，在病斑边缘有明显的界限，后随病势发展病组织软化，病斑变为褐色，且病健交界限逐渐模糊，出现腐烂并伴随恶臭味，待水分蒸发后，组织干缩[4]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本研究主要通过将Pba的edd基因回补到Pcc中来研究ED途径在致病过程中的主要作用。
研究内容：利用基因载体将黑腐果胶杆菌（Pba）中的edd基因导入胡萝卜软腐果胶杆菌（Pcc）并表达。
以此研究ED途径在致病过程中的主要作用。
3. 研究的方法与方案
研究方法：生物信息学分析目的基因的相关注释功能分子生物学手段进行基因片段的克隆、连接与转化，并对目的基因进行互补与验证技术路线：带flag标签PCR克隆eddpba片段酶切连接构建重组载体pBBR(eddpba) 转化大肠杆菌S17-1 PccS1 两亲 筛选重组子Western blot验证蛋白表达实验方案：（1）用引物eddpba-F和eddpba-R以PccS1基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到eddpba基因的片段，用EcoRI和Xba I进行双酶切；（2）将酶切后的eddpba片段连接到由EcoRI和Xba I双酶切的表达载体pBBR 上；（3）将重组载体pBBR(eddpba)转入Top10，并提取重组质粒，酶切验证；将得到的重组质粒pBBR(eddpba)转入S17-1中；（5）将菌株S17-1- pBBR(eddpba)和PccS1进行两亲同源重组并用Rif100 Gm50 的LB平板进行筛选以获得重组子PccS1(eddpba)，对长出的单菌落进行PCR 验证；（6）将验证后正确的重组子PccS1(eddpba)以及野生型过夜摇菌；（7）超声波裂解细胞提取总蛋白；（8）对提取的总蛋白进行western blot验证，确定目的基因是否表达；可行性分析：（1）实验材料：本实验室已有胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种PccS1，载体pBBR,大肠杆菌Top10菌株，S17-1菌株。
（2）实验技术：所在实验室在基因互补方面具备较为完善的实验方案和成熟的技术，实验仪器、设备齐全。
4. 研究创新点
特色或创新之处：将pba中的edd基因互补到PccS1中，通过比较不同软腐菌之间代谢途径的不同，分析其致病机理以及进化上关系。
5. 研究计划与进展
研究计划：2014年8月2014年9月 阅读文献及载体构建2014年9月2014年10月PccS1(eddpba)重组菌株的获得2014年10月2014年12月 蛋白提取以及western blot验证2015年1月2015年2月 整理结果和撰写论文预期进展：2014年12月正在提取蛋白进行western blot验证目的基因是否表达。
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