1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.研究目的与意义
小麦是世界上种植面积最大的粮食作物，我国是小麦种植大国和食用大国，其对我国的粮食安全有重要意义。随着社会的发展和生活水平的提高，人们对小麦品质的要求也越来越高。我国小麦育种和栽培工作者一直在致力于改良小麦品质。近年来，我国小麦品质有一定程度的改善，但同美国、加拿大等小麦生产大国强国相比，差距还很大。这与我国小麦品质形成理论和改良途径、优质小麦生产技术研究起步晚、研究相对滞后、以及我国麦制品消费类型同国外有较大差异有关。加强小麦品质调优理论与技术途径的研究，是促进我国优质小麦生产的必要举措，具有重要的理论意义和实际意义。
栽培上通常施用的硫肥是硫磺、硫酸钾、硫酸铵等。半胱氨酸和甲硫氨酸是含硫氨基酸。关于氨基酸态硫在小麦生产上施用还鲜见报道。氨基酸态硫结合无机态施用来改善小麦品质，以及对其生理机制的研究将会在施肥理论上和实践上需要得到进一步完善。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标
（1）明确含硫氨基酸对小麦产量和籽粒蛋白质组分及其含量的影响
（2）明确含硫氨基酸对GMP含量和GMP粒度的影响
3. 研究的方法与方案
1.研究方法：大田试验、肥料实验
2.技术路线：见附件
3.试验方案
3.1试验材料中筋小麦品种扬麦16，HMW-GS组成为Null，7 9，2 12。
3.2试验设计
试验地点在汤泉农场，采用大田试验，于2012年12月2日播种。随机区组试验：试验设置为2个硫肥水平，0kg/hm2(S0)和30kg/hm2(S30)。5个含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）和硫酸钾的配比：0：0：100%；5%：5%：90%；10%：10%：80%；15%：15%：70%；20%：20%：60%。小区面积8m2（2m4m）。磷肥120kg.ha-1，钾肥180kg.ha-1。氮肥240kg.ha-1。磷肥施用磷酸二氢钾，氮肥施用尿素，钾肥施用氯化钾和磷酸二氢钾。氮肥按基肥和追肥各占总肥料50%量施用，磷钾硫肥全部基施。各个处理设置三次重复。
N0S0 | 空白 |
N0S30 | 硫酸钾100% |
N240S0 | 尿素 |
N240S30AA-s0 | 尿素 硫酸钾100% 蛋氨酸0 半胱氨酸0 |
N240S27AA-s3 | 尿素 硫酸钾90% 蛋氨酸5% 半胱氨酸5% |
N240S24AA-s6 | 尿素 硫酸钾80% 蛋氨酸10% 半胱氨酸10% |
N240S21AA-s9 | 尿素 硫酸钾70% 蛋氨酸15% 半胱氨酸15% |
N240S18AA-s12 | 尿素 硫酸钾60% 蛋氨酸20% 半胱氨酸20% |
3.3取样、制粉和测定项目
3.3.1取样在小麦成熟期，每个小区随机选取1m2收获所有穗，用于测产。剥去籽粒，测籽粒含水量。样品在105℃下杀青20min,70℃烘干至恒重，磨粉，用于室内分析。
3.3.2制粉制粉细度均为100目。全麦粉用3100型实验磨磨制；用于蛋白质、巯基和二硫键测定。
3.3.3测定项目测定籽粒中蛋白组分和含量；测定GMP含量和粒度分布；测定HMW-GS和LMW-GS含量；测定籽粒蛋白中的巯基和二硫键的数目；测定产量及其构成因素。
3.4测定籽粒中蛋白质的含量和组分
采用半微量凯氏法测定子粒氮素含量，含氮量乘以系数5.7为蛋白质含量。分别测定清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白。
3.5GMP测定
3.5.1GMP含量测定
采用Weegels等[75]、孙辉等[76]和蔡铁等[63]的方法测定GMP含量，稍作改进。0.05g全麦粉加1.5%SDS提取液1mL，常温下15500g离心15min弃上清液,用双缩脲法测定残余物中氮含量作为GMP的近似值。
双缩尿法:用移液管加入10mL双缩尿试剂(在500mL容量瓶中依次加入30mL4%的Cu-SO4,100mL2.5%的酒石酸钾钠,再慢慢加入30mL5NKOH,用去离子水定容,使用时将此液与等体积透明的异丙酸混合,若溶液出现浑浊或沉淀,则不宜使用)。充分搅拌,于40水浴放置15min,然后6000rmin-1离心10min,取上清液用550nm波长比色测定光吸值,最后查标准曲线即得蛋白质含量。
3.5.2GMP粒度分析
参照Don等[77]和蔡铁等[63]的方法提取GMP凝胶。称取1.4g样品,放入50mL离心管,加1.5%SDS溶液28mL,混匀,80000g离心30min。取上层蛋白质凝胶1g放入10mL离心管,加1.5%SDS溶液5mL,混匀用LS13320激光衍射粒度分析仪分析GMP粒度。
3.6HMW-GSH和LMW-GS测定
参照梁荣奇等[78]和蔡铁等[63]的方法提取HMW-GS和LMW-GS。沉淀(GMP)中加入200μL样品缓冲液(含62.5mmolL1Tris-HCl，pH6.8，20%丙三醇，5%SDS，1%DTT)，60℃水浴振荡1h，10000g离心10min，上清液用于SDS-PAGE电泳。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%，胶厚1mm，20个上样孔，每个样品点样15μL，每板电流15mA。电泳结束后，用0.05%考马斯亮蓝R250染色24h,然后用蒸馏水脱色2d。
采取岳鸿伟等[45]的切胶比色法进行HMW-GS和LMW-GS定量。将脱过色的胶放入白瓷盘中，在日光灯下用刀片从凝胶上切下染上色的蛋白质条带，置玻璃试管中，加入1mL含有3%SDS的50%异丙醇，用封口膜封口，37℃水浴中静置24h提取HMW-GS和LMW-GS，于595nm下测定提取液吸光值。用不同点样量的标准蛋白(116kD)做标准曲线，计算各样品HMW-GS和LMW-GS含量，以各次电泳结果的平均值作为该样品HMW-GS和LMW-GS含量。
3.7测定籽粒中二硫键和巯基的数目
参照朱云集[79]、易翠平[80]的分析方法，稍有改动。称150mg面粉，用1mLTris-甘氨酸缓冲液混匀后加入4.7g盐酸胍,用Tris-甘氨酸缓冲液定溶到10mL。
小麦面粉中自由-SH含量的测定：取1mL样品提取液，加4mL8mol/L脲和0.1Ellmans试剂，混合均匀，于412处测定吸光值。
小麦面粉中S-S的测定：取1mL样品提取液，加0.1mL巯基乙醇和4mL脲盐酸胍,混合液于25℃保温1h,然后加10mL12%三氯乙酸,于25℃保温1h,5000g离心10min,用5mL12%三氯乙酸清洗沉淀两次,将沉淀物溶解于10mL8mol/L脲中,加0.04mLEllmans试剂,测定412nm处的吸光值。
3.8小麦籽粒氮代谢和硫代谢关键酶活测定
3.8.1谷氨酰胺合成酶（GS）测定
酶液提取：称取灌浆时期籽粒1.000g加入6mL(pH8.050mmol/L)的咪唑-HCl缓冲提取液(含2mmol/L的MgSO4，0.5mmol/LEDTA，10mmol/Lβ-巯基乙醇)，冰浴研磨，4℃下15000g离心20min，上清液即为酶液。
显色反应：取酶液700μL两份，分别加入1.6mL反应混合液A(pH7.8，50mmol/L的咪唑-HCl缓冲液，含20mmol/L的MgSO4，0.5mmol/LEDTA，60mmol/L谷氨酸和10mmol/LATP)和1.6mL反应混合液B(反应混合液A中加入10mmol/L盐酸羟胺)，混合均匀后，于30℃水浴反应30min，然后加入1mL显色剂(0.2mol/LTCA，0.37mol/LFeCl3和0.6mol/LHCl混合液)，摇匀后放置片刻，于5000g下离心10min，取上清液在540nm波长下测定吸光值。标曲制作：用γ-谷氨酰基异羟肟酸做标准曲线，以加入反应液B和反应液A的吸光值之差，根据标准曲线查得反应生成的γ-谷氨酰基异羟肟酸量，以每克鲜样酶粗液在单位反应时间内催化生成的γ-谷氨酰基异羟肟酸的μmoL数表示酶活性[81]。
3.8.2谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)活性测定
酶液提取：称取灌浆时期籽粒1.000g放入研钵，加0.05mol/LTris一HC缓冲液(pH7.2)2.0ml，在冰浴中研磨，得到的匀浆用高速离心机2000xg离心20min，上清液供测酶活度用。
显色反应：取10ml试管加酶粗制剂0.1ml和GPT底物液(200mmol/L-丙氨酸，2mmol/Lα-酮戊二酸)0.5ml(对照管，仅加酶粗制剂0.1ml)然后置37℃水浴，30min后取出，加2，4一二硝基苯阱液0.5ml终止反应(对照管再加GPT底物液0.5ml)。再置37℃水浴中20min，取出后加0.4mol/LNa0H5.0ml，混匀，10min后500nm比色。查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)，若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。工作曲线绘制：取10ml试管6支，各管加0.1mo比磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。以下操作同上，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线[82]。
3.8.3硫同化酶-O-乙酸丝氨酸硫水解酶(OAS-TL)的活性
称取籽粒1.000g置于预先冷冻过的研钵中，加入少量预冷的经酸洗过的石英砂和3ml提取液(30mmul/LTris一HCI，内含10mmol/Lβ-巯基乙醇)，冰浴下研磨至匀浆，倒入离心管，4℃下14000gx离心20min。取上清液0.1ml，加入1.0ml反应液(100nunol/LTris一Hcl，pH8.0，内含20mmol/LOAS，1mmol/LNa2S)，在34℃水浴下反应10min，加入0.2ml的终止液(1.5mol/LTCA)终止反应(有蛋白质沉淀的离心除去)。取终止反应后的溶液LOml，加入1ml的茚三酮溶液(250mg茚三酮溶解于10ml冰醋酸:浓盐酸为3:2(V/V)的溶液中)，沸水浴5min，然后迅速放置于冰上冷却，加入2ml冷冻过的100%的乙醇并混合均匀，在546nm波长测定吸光值。以胱氨酸做标准曲线，计算OAS-TL的活性[83,84]。
4.可行性分析：本实验室为农业部小麦区域技术创新中心，有仿工业磨粉机、凯氏定氮仪、激光粒度仪、面筋仪、面筋指数仪、面筋烘干仪、粉质仪、快速粘度分析仪，可进行籽粒蛋白质品质相关分析，有高速低温冷冻离心机、高速定时台式离心机、旋光仪、紫外-可见分光光度计、低温冰箱、烘箱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱仪、双向电泳系统等实验室仪器，可进行生理生化测定和分析。
4. 研究创新点
栽培上通常施用的硫肥是硫磺、硫酸钾、硫酸铵等。半胱氨酸和甲硫氨酸是含硫氨基酸。关于氨基酸态硫在小麦生产上施用还鲜见报道。氨基酸态硫结合无机态施用来改善小麦品质，以及对其生理机制的研究将会在施肥理论上和实践上需要得到进一步完善。
5. 研究计划与进展
1、2015.62015.7相关资料查询及整理，相关文献阅读。
2、2015.72015.12做室内分析，整理实验结果，并及时补做相关实验使结果更加完善
3、2015.12-2016.3数据整理总结及毕业论文撰写。
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