1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大豆花叶病是由大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus ，SMV）（马铃薯Y病毒科，马铃薯Y病毒属）引起的一种大豆病害，严重影响大豆产量和品质，在适宜环境条件下能引起大豆35-50%的产量损失(Wrather et al., 2001)。目前还没有有效的化学药物防治方法，利用大豆花叶病毒抗病基因，培育抗病品种是防治大豆花叶病毒病、保证大豆优质、高产、稳产，最经济、有效和安全的途径。 在世界范围内，根据SMV在不同抗性大豆品种上引发的症状反应，将其分为多个不同类型的株系群。在美国和韩国，根据SMV在鉴别寄主上的症状反应，将其划分为G1-G7 7个株系群（Cho and Goodman, 1979; Cho et al., 1983; Buzzell and Tu, 1984; Lim, 1985; Kim and Lee, 1991; Kim, 2003）。在中国，则根据其在不同鉴别寄主上的反应，将大豆花叶病毒分为SC1-SC22 共22个株系群（Yang, 2002; Wang et al., 2003, 2005; Guo et al., 2005; Zhan et al., 2006; Li et al., 2010）。 国内外学者以不同大豆材料和SMV株系研究大豆对SMV的抗性遗传机制，相继报道了大豆对SMV 的抗侵染遗传均由一对显性基因控制。此外还有一些其它抗性遗传方式的报道，如一对隐性抗性基因、两对显性互补抗性基因、两对隐性互补抗性基因和两对具有抑制作用的显性基因。这可能是因为不同研究者使用的抗源材料、病毒株系和抗性鉴定的环境甚至抗感划分标准不同所造成。研究者发现大豆对SMV的抗性多是由单显性基因控制，而且具有株系群特异性。譬如抗病基因Rsv1可以对G1-G5株系表现极端抗性，而对毒性较强的G6-G7株系表现感病；抗病基因Rsv3 对G1-G5株系表现感病，而对G6-G7株系表现感病；而抗病基因Rsv4 对G1-G7株系 都表现抗性(Kiihl and Hartwing, 1979; Jeong et al., 2002; Hayes et al. 2000)。在中国，从不同的抗性品种中发现了一些抗病基因：例如科丰1号中定位到的SMV抗病基因Rsc8 和 Rsc7被定位在大豆2号染色体上（D1b连锁群）(Wang et al. 2010; Yan et al., 2014)；大豆品种RN-9中的抗病基因Rsc15被定位于大豆6号染色体（C2连锁群）(Yang et al. 2010)；大豆齐黄1号中的抗病基因Rsc14Q and Rsc3Q被定位于大豆13号染色体（F连锁群）(Ma et al., 2011; Zheng et al., 2014)；大豆大白麻中的抗病基因Rsc4被定位于大豆14号染色体（B2连锁群）(Wang et al., 2011)。这些中国定位到的SMV抗病基因多数位于美国定位到的抗病基因附近，但这些抗病基因是等位基因还是紧密连锁的基因有待进一步探究。 Rsv1是国外从PI96983首次定位到的SMV抗性基因 (Yu et al. 1994)。 Zhang 等(2012) 证明一个或多个non-TIR-NBS-LRR（non-nucleotide blinding site-leucine rich repeat) 基因家族成员参与了Rsv1对SMV的极端抗性。Yang 等(2013)报道Rsv1区间内的两个或一个单显性基因(Rsc-pm和Rsc-ps)可分别调控PI96983对SC3, SC6和 SC17，及SC7的极端抗性。有报道称烟草对烟草花叶病毒（TMV，tobacco mosaic virus)抗病位点N内的一系列基因都和抗性相关(Whitham et al., 1994)。 番茄抗番茄叶霉病位点Cf-2中两个相同的基因具有小种抗性特异性 (Dixon et al., 1996)。因此大豆对SMV抗病位点很可能也是由多个株系特异性基因组成。一个极可能的Rsv1 具有CC-NBS-LRR结构的抗病候选基因3Gg2已经被发现(Hayes et al., 2004; Shi et al., 2008; Zhang et al., 2012)。Rsv3和Rsc4 被发现和3Gg2具有相似的结构特征(Suh et al., 2011; Wang et al., 2011)。然而，Rsv4、Rsc8 与Rsv1、Rsv3 不同，而且可能是一类新的抗病基因类型(Saghai et al., 2010; Wang et al., 2010)。 目前根据已克隆的抗病基因的保守结构特征，将植物抗病基因分为5类：(1) 具有NBS-LRR结构, 如烟草TMV抗病基因 N (Whitham et al., 1994) 和水稻白枯病(Xanthomona oryzae，Xoo) 抗病基因Xa1 (Yoshimura et al., 1998); (2) 具有富亮氨酸重复-跨膜结构 (LRR-TM，Leucine rich repeat-transmembrane)，如番茄抗番茄叶霉病基因Cf-9和Cf-2 (Jones et al., 1994; Dixon et al., 1996); (3) 具有富亮氨酸重复-跨膜结构-蛋白激酶 (LRR-TM-PK，Leucine rich repeat-transmembrane- protein kinase), 如水稻Xoo抗性基因Xa21和Xa26 (Song et al., 1995; Sun et al., 2004), 及马铃薯丁香假单胞杆菌抗性基因Pto (Martin et al., 1993)和小麦锈病抗性基因Lrk10 (Feuillet et al., 1997)；(4) 具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构(STK)，如大麦抗锈病基因Rpg1 (Brueggeman et al., 2002)；(5) 其他结构, 如水稻白枯病基因Xa5 (Iyer et al., 2004) 编码一个TFИA 转录因子。不同的植物对病原的抗性机制往往是保守的(Ronald and Beutler, 2010)，而且已克隆的抗病基因的结构特征将为SMV抗性基因的克隆提供重要的参考信息。 国内外在大豆对大豆花叶病毒抗性研究方面取得了许多重要进展，但仍有许多方向值得深入研究。这包括各国SMV 株系鉴定体系的统一，利用大豆基因组数据库发掘新的分子标记，确定SMV 抗性位点的功能性分子标记，探讨利用这些功能性分子标记以鉴定品种的抗性。另外，图位克隆SMV 抗病候选基因，并利用生物信息学技术，结合电子克隆、病毒介导的基因沉默和转基因等试验方法对SMV 候选抗性基因的功能进行分析，最终获得抗病基因是重点研究内容。
参考文献：
［1］杨永庆，智海剑，张孟臣.黄淮海抗大豆花叶病毒（SMV）育种现状与展望。华北农学报.2014，29（增刊）：103-108
2. 研究的基本内容和问题
大豆对大豆花叶病毒抗病基因Rsc18A被定位于大豆科丰1号2号染色体（D1b连锁群）不足100kb区段内，根据已公布大豆全基因组公共序列信息推测有6个候选基因。前期序列分析等已把候选基因锁定于其中4个基因，本课题旨在通过SMV诱导qRT-PCR分析、亚细胞定位等手段进一步鉴别、分析抗病候选基因的功能。
3. 研究的方法与方案
基因的功能最终是由其蛋白结构即核苷酸序列决定的，抗感亲本的表型差异也是由其蛋白结构和表达模式决定的，因而在抗病候选基因的筛选鉴定过程中，对其序列特征和表达模式进行探究是切实可行的方法。
技术路线：首先，大豆对SMV抗病基因Rsc18A的精细定位；其次，抗病候选基因的TA克隆及序列分析；然后进行抗病候选基因的SMV诱导QRT-PCR表达分析、抗病候选金银的组织特异性表达分析、抗病候选基因的Gateway表达载体的构建和抗病候选基因的农杆菌转化；最后对抗病候选基因的生物信息学分析和功能预测。
本课题针对定位区段内的6个抗病候选基因进行序列比对、组织特异表达分析、SMV诱导表达分析和亚细胞定位等研究，以期筛选鉴别出可能的抗病候选基因，从而为抗病基因的克隆、转基因应用等提供理论支持。
4. 研究创新点
大豆花叶病毒病是主要的大豆病害，SC18是全国范围内的流行株系，针对该株系的大豆抗病基因Rsc18A的定位、克隆、及后续MAS和转基因应用是防控SMV病害流行的经济有效的手段。本课题首次对Rsc18A进行克隆和表达分析，通过QRT-PCR和亚细胞定位等手段对候选基因的表达模式和功能进行初步探究。
5. 研究计划与进展
2015.7-2015.8抗病候选基因的TA克隆、测序和序列比对，生物信息学分析；
2015.8-2015.9对抗病基因设计特异引物，进行SMV诱导的QRT-PCR 表达分析和组织特异性表达分析；
2015.9 - 2015.10 抗病候选基因的Gateway表达载体构建, 及亚细胞定位。
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