1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义及目的 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界的1/3以上人口都依靠着它所生存。而在我国60%以上的人口以稻米为主食。所以，对于我国来说，杂交稻的种植更是格外重视。水稻杂交制种在生产过程中为提高异交结实率需要采取人工授粉、割叶和喷施激素等措施。这些措施不仅劳动强度高，操作技术强，而且需要专业知识和丰富的经验对水稻生长发育规律以及时机的把握。另外，割叶造成的伤口对水稻植株的正常生长也有不利。虽然施用赤霉素可以提高制种产量[1] 增大剑叶角度,达到穗粒正常外露，但大量的使用赤霉素不仅会加重稻粒黑粉病的发生，降低种子质量[2-6]，还会使得制种成本较高，污染环境。 因此，发掘GA3高敏感性种质资源和探究水稻剑叶角度的GA3敏感性指标与相关等位基因的SSR标记进行关联分析[7-10]，以检测与本研究相关的功能位点，从而改良水稻的制种性状，为研发提高制种产量，降低成本的轻型高效制种奠定坚实基础，进而加快杂交制种全程机械化。 国内外研究概况 剑叶角度是指水稻植株主茎与剑叶之间的夹角，它是构成水稻株型的主要因素之一。有研究表明[11]，剑叶角度受2对主基因＋多基因控制，以主基因遗传为主。标记分析显示有15个标记与剑叶角度呈极显著相关。利用两种分析软件 WinQTLCart2.5和QTL Network2.0共同检测到2个控制剑叶角度的QTL（qFLA2、qFLA8）。qFLA2 位于RM300-RM145区间, qFLA8位于RM6215-RM8265区间，这两个QTL增效等位基因都来自A7444。目前，已经鉴定了41个与剑叶角度有关的QTL。 还有研究表明[12]，控制剑叶角度对赤霉素敏感性的QTL共有3个,分别位于第3、9、9染色体上,其贡献率分别为5. 59%, 13. 00%和11. 80%,增效等位基因分别来自秀水79、C堡和C堡;控制株高对赤霉素敏感性的QTL共有2个,分别位于第1和8染色体上,其贡献率分别为8. 46%和10. 97%,增效等位基因分别来自秀水79和C堡;控制第1节间长度对赤霉素敏感性的QTL只有1个,位于第3染色体上,其贡献率为0.05%,增效等位基因来自C堡;控制第2节间长度对赤霉素敏感性的QTL也只有1个,位于第1染色体上,其贡献率为7. 34%,增效等位基因来自C堡。 研究[13]表明在剑叶角度性状上籼亚种比粳亚种对外源GA3敏感性高。恢复系应选择敏感性高的资源，保持系也应选择敏感性高的资源。 综上所述，检测水稻剑叶角度的GA3敏感性指标与相关等位基因的分子标记的功能位点，是加快水稻机械化制种，节约成本和降低环境污染的有效方法。 应用前景 通过改良水稻的制种性状，为研发提高制种产量，降低成本的轻型高效制种奠定坚实基础，进而加快杂交制种全程机械化。减少环境污染。 主要参考文献 [1] 袁隆平.杂交水稻学[M].北京：中国农业出版社，2002:247-255. [2]皮勇华，贺芳，徐志文，等。赤霉素在杂交水稻制种上的作用与机理[J ].江西农业学报，2007,19 （10）：25-27. [3]李安详,李慈厚,丁克信,等. 杂交制种稻粒黑粉病的综合防治[J].江苏农业科学,1995(4):34 -36. [4]黄胜忠，陈红光，钟日生，等.杂交稻制种稻粒黑粉病的综合防治技术[J]. 杂交水稻,2007,22（2）: 43-47. [5]董海军.杂交水稻制种产量和质量的因素[J].种子科技，2002,20（1）：33-35. |
[6]付淑换,郭媛,洪德林,等.粳稻异交相关性状对外源赤霉素敏感性的QTL定位研究[J], 安徽农业科学, 2010,38(9) : 44504453. [7]党小景，刘强明，HOANG Kim Toan,等.水稻四个产量性状的SSR关联分析[J].南京农业大学学报,2014，37(4):1-8. [8]Bresehello F, Sorrells ME. Association mapping of kernel size and milling quality in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Genetics, 2006, 172: 1165-1177 [9]Li XB, Yan WG, Agrama H, et al. Mapping QTLs for improving grain yield using the USDA rice mini-core collection. Planta, 2011,234 :347-361 [10]文自翔，赵团结，郑永战，等.中国栽培和野生大豆农艺及品质性状与SSR标记的关联分析I：群体结构及关联标记.作物学报，2008,34（7）：1169-117 [11] 付淑换,郭媛,洪德林,等. 粳稻异交相关性状对外源赤霉素敏感性的QTL定位研究[J] . 安徽农业科学，2010，38(9) ： 44504453. [12] 胡文德，张红，江建华，等. 粳稻大剑叶角资源的发现及剑叶角度的遗传分析与ＱＴＬ定位[J] . 中国水稻科学，2012，26(1) ：34-42. [13]胡文德，孙大运，江建华，等. 100份水稻资源对外源GA3敏感性比较[J] . 南京农业大学学报，2010，33（6）：7-12. |
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容
本实验室通过调查了506份水稻资源对外源GA3的敏感性，并以剑叶角度的GA3敏感性指标与相关等位基因的SSR标记进行关联分析，以达到加快水稻机械化制种，节约成本和降低环境污染的目的。
拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
研究方法
1.1 供试材料
本试验材料为506份水稻资源，由杂交稻种质创新实验室提供。
1.2 田间种植和试验方法
2016年5月10日将供试的506份水稻资源播于南京农业大学江浦试验站播种，6月10日移栽。每份资源栽插1个小区，每个小区4行，每行8株。每个小区任选三株分别涂抹GA3作为处理，每株涂抹主茎穗，挂牌做标记，另选三株不处理作对照。株距20cm,行距20cm.常规田间管理。
GA3涂抹方法按制种实际进行，在水稻幼穗分化三期或四期进行涂抹，GA3总用量为0.1mg，涂抹浓度0.1mg/mL， 分三次涂抹，按3：4：3的比例，连续3天上午进行,即当天上午涂抹300ul,第二天上午涂抹400ul，第三天上午涂抹300ul。（洪德林.2014.种子生产学实验技术）GA3处理液由三六牌75%赤霉酸（上海同瑞生物科技有限公司生产）和蒸馏水配成（配制前用少量的酒精进行溶解），用脱脂棉进行涂抹。每次涂抹GA3处理液时，均匀地涂抹到每株倒二叶上。
1.3 表型鉴定
第三次涂抹以后每隔7d进行一次观察，至植株完成抽穗定型后进行性状调查，调查剑叶角度这个性状。剑叶角度：剑叶叶枕以上茎秆或稻穗（如弯曲需竖直向上拉直）剑叶基部所在直线形成的夹角，精确到1。
1.4基因组DNA提取、SSR标记基因型鉴定和等位基因鉴定
基因组DNA提取、PCR扩增体系、采用6%PAGE非变性胶进行电泳；电泳完毕后银染、显影方法参见Bassam等。
1.5数据分析
1.5.1表型分析
性状对外源GA3的敏感性用2个指标衡量。一个是差值（difference，D）,即将由调查性状的外源GA3处理平均值（mean of treatment，MT）减去不作处理的对照平均值（mean of check，MC）而得到。即D=AT-AC。D反映调查性状经外源GA3处理后的绝对变化，当D为负值时，认为是由实验误差或取样误差造成，将D记为0。另一个指标是敏感指数（index of GA3 sensitivity，IGS），IGS=D/AC100%，IGS越大，表示对外源GA3的敏感性越高。
在Microsoft Excel 2010软件上，将506份水稻自然群体对GA3敏感反应的表型数据进行处理，分别求出平均数、标准差、最大值、最小值、变异系数、广义遗传率；并在方差分析软件中对数据进行方差分析。广义遗传率用以下公式进行计算：
其中，σ2g表示遗传方差；σ2e表示误差方差；n表示重复数。此参考盖钧镒的《试验统计方法》中介绍的方法。
1.5.2群体遗传多样性分析
应用统计软件PowerMarker3.25，对506份水稻自然群体资源进行标记位点的遗传多样性分析（Liu和Muse，2005）：计算各位点的等位基因数（number of alleles per locus）、基因多样性（gene diversity）和多态性信息含量（polymorphism information content, PIC）。
等位变异频率指的是某位点上的特定等位变异在群体中出现的次数占该位点上所有等位变异出现的次数。计算公式如下：
其中，Pij为第i个位点上第j个等位变异的频率；Aij是总群体中第i个位点上第j个等位变异出现的次数；m指总群体中第i个位点上所有等位变异出现的次数。
每个位点的基因多样性计算公式如下：
其中，He为第i个位点上的基因多样性；n为总检测的位点数；Pij为第i个位点上第j个等位变异的频率；f指近亲系数；
每个位点的多态性信息含量（PIC）计算公式如下：
其中，Pij指第i个位点上第j个等位变异的频率；Piv指第i个位点上第v个等位变异的频率；n指所测位点的等位变异总数。
1.5.3群体结构分析
基于506份水稻资源的分子数据，应用STRUCTURE 2.2上对品种总群体结构分析（Pritchard等，2000）。根据各位点等位基因型频率，利用统计软件PowerMarker3.25计算的Nei遗传距离，构建了Neighbor-Joing聚类图，使用MEGA5.0 软件进行观察。
1.5.4连锁不平衡分析
使用标准不平衡系数(D′)衡量位点间LD 程度。D′值的理论化范围为0~1。一般将小于0.5作为LD 衰减的标志。参考Mather等（2007）提出的方法，选取不同染色体上的成对位点的第75个百分点的r2值作为背景LD来定义提高了的LD。r2值的计算在软件TASSEL2.1上进行（Bradbury等，2007）。然后基于同条染色体上的成对位点的r2值和SSR位点间的遗传距离，绘制LD衰减散点图来观测LD与遗传距离的关系。
1.5.5农艺性状关联位点以及优异等位变异的确定
将上述在软件STRUCTURE2.2上的运算结果中的Q值作为协变量，使用软件TASSEL2.1中的一般线性模型（General linear model, GLM）程序来分析目标性状与标记之间的关联。在P 0.01时，就认为目标性状与标记呈显著性关联。并且参考Benjamini和Hochberg（1995）提出的矫正方法，设置FDR 0.01作为位点显著关联的阈值。
在已经获得的与籽粒充实度显著关联的位点基础上，参考Breseghello和Sorrells （2006）提出的无效等位变异（null allele）方法，来计算其他等位变异的表型效
应值。在群体中出现的频率小于5%的等位变异被视为稀有等位变异，此种等位变异作为缺失数据处理。计算位点全部增效(减效)等位变异的平均效应（average allele effect of locus, AEE）作为该位点增效能力的整体评价。计算方法为：
其中，AAE为某关联位点内所有增效（减效）等位变异的平均值；∑a为某关联位点内所有增效（减效）等位变异表型效应值的总和；n为该关联位点内增效（减效）等位变异个数。
技术路线
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可行性分析
应用可行性分析：本实验在前人胡文德的基础上，进一步探究剑叶角度对外源GA3的敏感性，以便发掘高敏感性大角度种质资源，从而达到降低激素污染，节约成本、免割叶的目的，加快水稻制种全程机械化，此具有重要的应用前景，可以应用于实际生产中。
试验环可行性境分析：506份水稻资源播种于南京农业大学江浦试验站，环境可控。
技术可行性分析：所使用试剂、耗材均由国家重点实验室水稻杂种优势和种子生产实验室提供；本实验所采用的的技术均由洪德林教授专业团队指导。
综上所述，本实验各方面均具有一定的可行性，可以开题。
4. 研究创新点
特色或创新之处
本实验针对前人胡文德的喷施激素的方法，加以改进，使用涂抹，可有效的控制每株主茎穗的涂抹量，从而使激素最大发挥效能。此外，通过发掘优异等位变异功能位点，从而为改良水稻自然群体的制种性状，为研发提高制种产量，降低成本的轻型高效制种奠定坚实基础，进而加快杂交制种全程机械化。这是本实验最大的特色。5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
研究计划：2016年5月10日，播种两天
2016年6月12日，移栽
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