1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大豆是世界上重要的经济作物之一，大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的幼苗猝倒和成株的根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，对大豆的生产造成严重损失，每年导致的全球直接经济损失可高达十几亿美元[1]。
据统计，虽然应用了诸如化学防治技术、种植抗病品种、栽培技术改良等多种方法，但是在全球范围内植物病害每年仍会导致约15%的作物产量损失[2]。
目前，生产上对大豆根腐病的防控存在缺少高效杀菌剂、病原菌产生抗药性、作物抗性容易丧失等问题。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标： 筛选大豆疫霉菌中具有诱导植物免疫活性的相关蛋白，并进行相关功能的分析，为研发植物免疫诱抗剂提供理论基础。研究内容：本研究主要以引起大豆根腐病的重要病原菌大豆疫霉为研究对象，开展以下几部分的研究工作：
1、鉴定大豆疫霉菌免疫诱抗候选蛋白；
2、大豆疫霉菌免疫诱抗候选蛋白活性的初步分析；3、原核表达大豆疫霉菌免疫诱抗相关蛋白，观察其诱导细胞死亡能力，进行活性氧测定以及植物防卫相关基因的表达检测，进一步对该蛋白进行免疫诱抗活性分析；4、用纯化后的蛋白处理植物后接种不同的病原菌，观察该蛋白的抗菌活性；5、大豆疫霉菌免疫诱抗相关蛋白的其他功能分析。拟解决的关键问题：1、能否筛选得到大豆疫霉菌中能够诱导植物免疫的相关蛋白；2、能否通过原核表达系统得到纯蛋白；3、纯化获得的蛋白是否具有抗菌活性；3. 研究的方法与方案
研究方法：
本试验通过对大豆疫霉菌的发酵培养，获得培养滤液。纯化滤液中获得的外泌蛋白，送样品至公司进行蛋白组学测序。经过蛋白组学及生物信息学分析鉴定，得到一些有潜在免疫诱导活性的候选蛋白，然后进行相应的基因克隆。将获得的目的基因片段构建到植物表达载体上，得到相应的植物表达载体。并且通过JM109大肠杆菌感受态细胞转化得到阳性克隆。经测序正确后电转农杆菌，注射烟草，观察烟草表型变化。对于能够诱导烟草细胞坏死的，再次进行基因克隆，将获得的目的基因片段构建到原核表达的载体上，然后进行原核表达。通过液体培养、蛋白诱导、离心破碎、蛋白纯化等一系列操作获得纯蛋白。后续利用纯化后的蛋白，进行以下几部分操作：
1、用纯蛋白注射烟草叶片，观察烟草表型变化；
4. 研究创新点
本研究以引起大豆根腐病的重要病原菌大豆疫霉菌为研究对象，利用蛋白组学分析、基因克隆、蛋白纯化、蛋白活性分析等技术手段，筛选并鉴定大豆疫霉菌能够诱导免疫活性的相关蛋白。拟以免疫诱抗相关蛋白为研究对象，研究其诱导植物免疫的活性，抗菌活性及其他活性功能，为研发新型的植物免疫诱抗剂，为大豆根腐病的防治提供理论基础，开辟防治新途径，为有效地病害防控策略提供新的思路及方向，对设计和改造抗病性有重要意义。
5. 研究计划与进展
（1）2018年8月1日-9月1日：对大豆疫霉菌进行发酵培养，获得培养滤液。纯化滤液中获得的外泌蛋白，送样品至公司进行蛋白组学测序；（2）2018年9月2日-9月5日：对质谱数据进行蛋白组学及生物信息学分析；（3）2018年9月6日-9月13日：克隆基因，并将目的基因连接到目的载体上，构建植物表达载体；（4）2018年9月14日-9月22日：转入JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂Kana板，并挑取阳性克隆PCR验证后揺菌，提质粒，送公司测序；（5）2018年9月23日-9月30日：序列比对后，将正确的质粒电击转入GV3101农杆菌感受态细胞，涂板，挑取阳性克隆PCR验证，揺菌后注射烟草（本氏烟），观察表型；（6）2018年10月8日-10月14日：验证表达后提取植物总蛋白，同时进行Western blot验证；（7）2018年10月15日-10月25日：克隆基因，并将目的基因连接到目的载体上，构建原核表达载体；（8）2018年10月26日-11月18日：转入JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂氨苄抗性板，并挑取阳性克隆PCR验证后揺菌，提质粒，送公司测序；（9）2018年11月20日-12月15日：序列比对后，将正确的质粒转入Ressetta.D感受态中进行原核表达蛋白诱导，并通过离心、破碎、纯化等步骤获取纯蛋白；（10）2018年12月16日-12月31日：调节纯化后蛋白的浓度，注射烟草叶片，观察烟草表型变化；（11）2019年1月3日-1月9日：活性氧的测定；（12）2019年1月10日-1月15日：Marker gene检测；（13）2019年2月25日-3月10日：利用纯蛋白处理不同植物叶片后，接种不同的病原菌，观察该蛋白对不同病原菌的抗菌活性；（14）2019年2月-4月：总结实验结果，补充实验，撰写毕业论文。
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