1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
NLR（核苷酸结合富亮氨酸重复序列）家族是动植物免疫识别受体中的一个重要家族，是植物中种类最丰富、进化最快的蛋白质家族之一。对于NLR的传统研究认为，植物的胞内受体NLR能够识别病原菌分泌的具有毒性的效应因子 （effect），并且激活下游效应因子触发免疫（Effect-Triggered Immunity，ETI）, 从而保护植物免于病原物的侵染；较新的研究认为，这一识别过程需要两种类型的NLR蛋白参与：一种是直接识别病原物的感受NLR（“sens” NLRs）；另一种则是协助启动免疫反应的辅助NLR（“helper” NLRs），二者可以引发植物细胞发生过敏反应（HR）而坏死，来限制病原物的进一步侵染。现代研究认为，基础的“基因对基因”假说已经不足以解释病原菌与寄主植物复杂的互作机制，因此在此基础上提出了有宿主蛋白参与的“诱饵模型”，以此来描述宿主的抗病机理，而NLR蛋白的作用原理符合这一模型，即所谓的“感受NLR”包含病原物效应因子的结合结构域，负责效应因子的识别；另一个NLR因子即所谓的“辅助NLR受体蛋白”负责启动下游的信号传递。例如在拟南芥的RRS1/RPS4蛋白对介导的抗病反应中，效应因子将RRS1蛋白C端的WRKY结构域（诱饵结构域）误认为靶标位点，从而与RRS1蛋白结合，进而激活了RRS1/RPS4蛋白对，引发下游免疫反应10；又如Rpi-blb2基因为马铃薯提供了对致病疫霉的抗性，相关的抗病品种已应用于农业生产。深入的研究发现，NRC家族的NLR蛋白之一——NRC4，与Rpi-blb2基因形成一组NLR蛋白对，共同介导这一过程中的抗病反应。研究者认为，这两种类型你的NLR蛋白形成了一个复杂的信号网络，而这一网络增强了免疫系统的可进化性和鲁棒性，从而使得植物能够抵抗快速进化的病原体。这些研究证明了NLR在植物抗病反应中起到的重要作用；也体现出了我们对NLR具体作用模式与信号网络的了解的不足。
参考文献：
2. 研究的基本内容和问题
虽然近年提出的宿主蛋白参与识别病原物的所谓“诱饵模式”似乎可以解释许多情况下的宿主-病原物互作过程，尤其是在一些NLR所参与的信号传导过程中得到证实，但进一步的研究证明这些过程背后可能具有更加复杂的机制。例如在前文所描述的Rpi-blb2基因与NRC4蛋白的互作关系，进一步的研究表明，对于不具有Rpi-blb2基因的植株中，沉默NRC4后植株对于致病疫霉的感病程度不具有统计学上的差异，而激光共聚焦显微镜观察发现Rpi-blb2特异性定位在病原菌吸器附近，而NRC4蛋白是完成这一定位所必需的。这一研究表明，NRC4可能仅对Rpi-blb2介导的免疫反应有协助作用，而这一作用与辅助Rpo-blb2正确定位有关，但更深层的信号渠道还有待进一步研究。又如现有研究证明NLR蛋白可能是通过介导寄主细胞发生过敏反应(HR)引起细胞坏死来阻止病原菌的进一步侵染，但番茄NLR基因Ｍi－l．２基因使番茄产生对根结线虫、蚜虫与马铃薯烟粉虱三种有害生物的抗性，这种广谱抗性显然不能简单的通过过敏反应实现，那么这些抗性的进化过程是怎样的？通过怎样的途径发挥作用？这些问题还有待深入的研究与观察。总之，对于NLR的具体进化过程、作用机理、与调控方式，我们还缺乏足够深入的认识，而这正是进一步研究的目标。我选取Rpi-blb2与NRC4这一对已有一定研究基础和相关材料的NLR蛋白作为研究对象，尝试研究它们作用过程中的功能特性，以此为进一步研究其互作过程打下基础。
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3. 研究的方法与方案
动植物体内的NLR在结构上具有显著地相似性，都具有N-端结构域、核酸结合结构域（NBD）和亮氨酸重复域（LRR）三个部分，但它们在功能和作用机理上有着较大的差异，例如在动物中NLR并不引发过敏反应，而是引起细胞的程序性死亡（PCD）3。前文已描述NLR蛋白对通过诱捕效应因子的“诱饵模式”识别效应因子，并激活下游的免疫反应，在这一过程中位于感受NLRC端的整合型诱饵结构域（ID）起着关键的作用。含有ID序列的NLR蛋白已在多种植物中被发现与识别，而基于基因组序列分析的生物信息学预测方法也已被证明可行；而确定了目标NLR序列后，我们便可以根据序列信息设计引物，从而通过PCR反应扩增目标片段，然后对其进行进一步的研究和分析。例如孟繁露利用PfamScan软件对水稻中的NLR序列进行了筛选，选取了其中包含有WRKY结构域（诱饵结构域）的NLR蛋白对RPR1和RPR2，然后对其进行了金门克隆、质粒载体构建实验，获得含有这两个基因的质粒载体后使用农杆菌在烟草中瞬时表达进行进一步的HR反应观察、细胞定位观察等，获得成功3。这一研究也展示了对NLR基因进行研究的基本模式，也证明了这一研究思路可行性。我希望以类似的模式，发觉发掘更多NLR蛋白的作用特性、作用机制，并依次为抗病品种的选育提供理论依据。参考前人的研究成果，我希望从类似的方向出发，进一步研究NLR在植物抗病反应中扮演的角色。我将我将会继续针对Rpi-blb2与NRC4开展相关工作，一方面构建改变其定位及结构域的突变体，通过显微观察验证其表达情况，并测试其对植物抗病性与HR反应强度的影响，一方面通过分别表达NRC4蛋白的各个结构域，研究其在植物抗病反应中发挥的作用。这一研究在前人工作基础上开展，参考了相关的研究方法，所使用实验材料均已获得，具备充足的可行性。
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4. 研究创新点
目前，对于NLR蛋白介导抗病过程的相关研究还在起步阶段，尤其对于抗性生效过程中的信号通路与抵抗的机理，现有研究尚且相当不足。现阶段的相关研究主要还是以“基因对基因”的作用模型为基础，而NLR蛋白对所可能具有的“诱饵模式”的作用方式是现住有别于传统认知的，因此传统的研究方式将在面对NLR介导的植物抗病反应时遇到阻力。此外，关于NLR蛋白对的具体情况，现有的研究主要局限于通过大量的HR反应筛选、确认不同Sens NLR发挥作用所需的Helper NLR，但对于其具体互作过程与作用特点，我们仍然知之甚少。本研究针对Rpi-blb2与NRC4互作过程中的功能特性开展，将进一步挖掘NLR蛋白作用机理，并为研究其具体的信号传递过程提供思路。
5. 研究计划与进展
2018年下半年，在南京农业大学卵菌与真菌分子生物学实验室学习相关基础理论和基本实验操作，掌握引物设计、PCR、载体构建、农杆菌介导的瞬时表达、酵母双杂交等在研究基因作用效果时有着重要作用的实验操作，参与研究致病疫霉效应因子在侵染过程中对宿主产生的影响及作用机理，并且进一步学习关于病原菌与寄主植物互作的相关理论知识，学习病原菌侵染与寄主植物抗性表达的经典模型。目前这一阶段已基本完成，掌握了实验室常用实验操作，并培养了一定的实验素养。
2019年上半年，赴英国伦敦帝国理工学院植物与微生物分子生物学实验室开展关于NLR作用机理和信号网络的进一步研究，期望能具体通过实验发现与验证Rpi-blb2与NRC4作用过程中的相关功能特性，并尝试以此为基础开展对其作用机理的进一步研究。
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