1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
玉米是我国重要的粮食作物。据统计，我国的玉米种植面积已经将近2000万hm2，在粮食作物种植中仅次于水稻和小麦。随着农业技术的发展，我国的玉米种植方式和玉米产量已经得到了很大发展。
近年来,由于制种基地土地资源有限，玉米制种在栽培制度方面有所改变（提早播期、采取密植、偏施氮肥、连作重茬)、抗病品种单一化种植和气候变迁等原因,玉米病害发生严重,常年造成损失10%以上,大发生时达30%~40%[1],严重地块甚至绝收,已成为提高产量和改善品质的限制因素。玉米青枯病、顶腐病系属真菌性病害，在植株的整个生长期均可以发病，严重危害我国玉米生产。
玉米青枯病又称玉米茎腐病、玉米茎基腐病，是世界性的玉米病害，也是暴发性非常强的一种病害，传染性非常强。自20世纪70年代中期以来,玉米青枯病在我国的河南、河北、广西、吉林等20多个地区相继发生[2]。目前我国的玉米青枯病发生面积不断扩大,危害逐年加剧,一般年份产量损失20%左右,严重时损失可达50%以上[3]，已成为继大斑病、小斑病和丝黑穗病之后我国玉米生产上又一重要病害。青枯病是由几种镰刀菌或腐霉菌单独或复合侵染所引起的为害玉米根和茎基部的一种土传真菌病害,该病菌属半知菌。土壤中的越冬菌源,在玉米播种后至抽穗吐丝期陆续由根系入侵,在植株体内蔓延扩展。玉米收获后,病原菌随种子和病株残体越冬,成为第二年的侵染来源[4]。玉米青枯病在玉米灌浆末期和乳熟期开始发病,乳熟末期至蜡熟期病症达到高峰期。从感病到全株枯死8~10d,最快3~5d,较慢的15d左右,在植株各部表现的症状不一。青枯病主要危害玉米整个根部与茎基3~4节,病原菌侵染后,根部表现空心变软变褐,须根减少[5]。青枯病的危害主要体现在玉米产量上，病害造成果穗顶部养分供应不足,顶部籽粒衰退,秃尖多,结实少,甚至不能结穗。而且发病越早,对产量影响越大，一般早期发病的植株比正常植株减产30%~50%[6]。同时，青枯病使茎秆损坏或倒伏,给收获带来了不便和麻烦。倒伏的玉米无法进行机械收割,增加收获困难,费时费工,徒添成本。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.1研究目的
①初步鉴定玉米profilinA的功能作用；
②采用优化的玉米TRV-VIGS体系，以profilinA为靶基因，初步分析profilinA在抗病中的。
1.2研究内容
1.2.1玉米幼根、幼叶总RNA提取
①植物样品处理
选择长势一致、第一片真叶即将展开的先玉335幼苗，以浓度为1×107cfu/mL的亚粘团镰孢菌孢子悬浮液浸泡根部约15分钟，以空白PDA培养基为对照，分别设置3个生物学重复。接种亚粘团镰孢菌后48h时，取玉米幼根、第一片真叶于液氮速冻，保存于-80℃。
②玉米幼根、幼叶总RNA提取
按照Invitrogen Trizol试剂盒说明方法提取玉米幼根总RNA：⑴取玉米幼根、幼叶混合样（0.1～0.2g）放入液氮预冷的研钵中，用研杵研磨样品，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。用液氮中预冷的药勺迅速移入预冷的2mL离心管中。⑵加入1mLTrizol试剂，盖紧管盖，轻轻地上下颠倒5～8次至样品混匀。⑶放置于冰上1～2min，加入250μl氯仿，轻轻地上下颠倒混匀。⑷室温静置2～3min，12000rpm 4℃离心10min。⑸吸取上层水相约600至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min。⑹12000rpm 4℃离心10min，小心弃去上清液（注意不要丢失RNA沉淀物），加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀物，12000rpm 4℃离心5min。⑺重复一次⑹。⑻弃上清液，将离心管（底部带有RNA沉淀物）倒置在吸水纸上吸干管口的乙醇，平放吸水纸上晾干RNA沉淀物，加入30～100l无RNA酶的DEPC水，弹击管壁溶解沉淀。⑼取2lRNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余放于-80℃冰箱保存。
③real-time qRT-PCR验证
转录合成cDNA在微量离心管中配制反应液：
| 5×Prime Script R TM aster Mix Total RNA RNaseFree ddH2O | 4l 1000ng Xl |
| Total | 20l |
轻轻吹打混匀后进行反转录反应：37℃15min；85℃ 5s。反转录后合成的cDNA保存于-20℃。
1.2.2 PCR引物设计
根据maizeGDB中公布的玉米模式基因基因序列（Zm00001d043523）进行相关信息查找，获得ORF序列，利用软件Bioxm2.7进行引物设计:
表1-1 PCR引物
| 名称Name | 序列Sequence（5'-3'） |
| ZmPROA-F | ATGTCGTGGCAGACCTACGTCGAC |
| ZmPROA-R | CAGGCCTTGCTCTACGAGGTAG |
1.2.3 PCP扩增目的基因片段
配制反应体系10l：
| 10×Buffer rTAQ酶 dNTP(2.5mM) cDNA 上游引物 下游引物 ddH2O | 1.0l 0.1l 0.8l 0.4l 0.4l 0.4l 6.9l |
| Total | 10l |
扩增程序：
98℃30s；98℃1min；55℃30s；72℃1min；35个循环；72℃延伸7min；4℃保存10min。扩增结束后跑1%琼脂糖凝胶电泳检测，或者于-20℃保存。
1.2.4PCR产物的回收纯化测
按照Favor Prep TM GEL/PCR Purification Kit试剂盒操作说明回收PCR产物。操作步骤：
⑴将大约300mg的含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶切下（尽量将多余部分切除），放入干净的2ml离心管中。
⑵向装有胶块的离心管中加入500l FADF Buffer（若琼脂糖凝胶体积500mg，则加入1000 l FADF Buffer），涡旋混匀。
⑶55℃水浴放置5～10min，期间每2～3min上下轻轻翻转离心管，直至胶块完全溶解。⑷将样品混合液冷却至室温。并且将试剂盒中的FADF Column安置在Collection Tube上。⑸将上述样品混合液约800l转移至FADF Column中，11000×g离心30s，弃滤液。
⑹将750lWash Buffer（已加乙醇）加入FADF Column中，11000×g离心30s，弃滤液。⑺将FADF Column安置在Collection Tube上，以最大转速（18000×g）离心3min。
⑻将FADF Column安置于新的1.5ml的离心管上。
⑼在FADF Column膜的中央处加入40l的Elution Buffer，室温下静置1min。⑽最大转速（18000×g）离心1min洗脱DNA。放置于-20℃保存。
1.2.5 PCR产物鉴定
将胶回收产物与pMD19-T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布筛选单克隆，并进行菌液PCR扩增检测，PCR鉴定阳性后送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序以及序列BLAST分析。
1.2.5.1目的片段与pMD19-T载体的连接
按照pMD19-TSimpleVector（Takara）试剂盒方法进行，在微量离心管中配制反应液：
| pDM19-TVector SolutionI 目的片段 | 0.5l 2l 2.5l |
| Total | 5l |
涡旋混匀，瞬离后置于16℃反应12h。
1.2.5.2大肠杆菌DH5α感受态的转化
(以下操作均在无菌环境下进行)
（1）-80℃取出感受态，立即用受加热后插入冰上，冰浴5-10分钟至解冻；
（2）加入2-5l连接好的治理混合液，轻震后插入冰中30分钟；
（3）轻摇后插入42℃水浴锅中90秒热休克后迅速放回冰中，静置5分钟；
（4）向管中加入800l空白LB培养基，37℃恒温振荡1.5小时；
（5）将离心管于5000g离心1分钟，弃大部分上清液，将剩余200l混合液打到含Amp的LB6.固体培养基平板上，涂布均匀；
（6）标记名称，日期，37℃恒温倒置，培养过夜。
待长成单菌落，用无菌牙签挑选白色的阳性克隆，并经菌液PCR再次鉴定为阳性后，送测序。
1.2.6 TRV病毒重组载体的构建
将阳性质粒pMD19-T-ZmPROA和pTRV2质粒分别经XbaI和BamHI双酶切后回收，利用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，涂选择性LB平板（含Kan50mgmL-1），37℃倒置过夜培养，挑取单克隆摇菌，进行菌液PCR检测和质粒双酶切鉴定，得到重组载体pTRV2-ZmPROA。将构建的正确的重组载体质粒转化农杆菌GV3101感受态，涂布选择性YEB平板（含Kan50mgmL-1、Rif50mgmL-1），于28℃倒置培养2d至形成单克隆菌落，通过菌液PCR鉴定出阳性携带pTRV2-ZmPROA的GV3101农杆菌菌液。
1.2.6 profilinA抗病鉴定
以profilinA为靶基因（包括在抗病的先玉335中上调或下调表达基因）设计干扰靶位，克隆到pTRV2质粒，与pTRV1共转化农杆菌GV3101菌株，将农杆菌通过真空辅助侵染玉米种子，2周后，接种亚粘团镰孢菌菌株的孢子液。接菌2周后，观察植株发病情况并统计病情指数，采用qRT-PCR检测靶基因沉默的程度，分析沉默基因与玉米个体发病之间的关系，初步鉴定靶基因在玉米顶腐病抗性方面的功能。
1.3拟解决问题
①初步鉴定profilinA在抗玉米顶腐、青枯病中的作用
3. 研究的方法与方案
2研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
2.1研究方法
①提取RNA
4. 研究创新点
①ProfilinA基因有很大的挖掘空间。
②VIGS技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制，目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大潜力。然而目前VIGS体系应用中对玉米的研究甚少。因此我们对于玉米VIGS技术的研究一种方法的创新。
③玉米顶腐病相关基因及其功能的研究报道较少，开展这方面的研究将有利于玉米育种工作的后期工作。
5. 研究计划与进展
4. 项目研究计划及预期进展
2019年9月-2019年10月profilingA的克隆与测序；
2019年11月-2019年12月抗病鉴定；
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
