1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
我国是棉花生产大国也是棉花消费大国，棉花是关系国民经济和人民生活重要战略物资。杂交优势利用是提高棉花产量、品质和抗性的重要途径。
棉花是一种利于利用杂种优势的作物[1]。2016年，杂交棉在我国的推广面积约75.2万hm2，占全国种植棉花总面积的20.0%[2]。陆地棉具有早熟的优点，将其作为母本与优质海岛棉进行杂交可以集合父母本的优势进而产生超越亲本的后代[3]。世界上最早开展棉花杂种优势研究的是美国（1894），我国始于20世纪20年代，在棉花杂种优势研究的一百年来，取得了较为显著的成就，目前我国大田生产推广最大的是中棉所29号，自1996年生产推广至今仍有很大种植范围。生产中利用杂种优势的主要途径是人工去雄杂交制种、利用棉花雄性不育系进行杂交制种、化学杀雄法以及利用指示性状等。我国主要运用三系法、两系法，以及改良的二级法[4]~[6]。
雄性不育指植株雌性生殖器官正常发育，而雄性器官畸形或退化，无法正常发育形成可育花粉进而丧失功能的现象，是棉花不育系杂交制种的关键，可节本省工，同时还可以免去人工去雄不彻底等问题。雄性不育又可分为胞质不育系和核不育系和生态敏感型雄不育系。胞质不育系（Cytoplasmic male sterilitty，CMS），又称质核互作不育系，但其细胞质中含有产量不利因子，而育性难恢复，同时杂种优势较弱，可利用品种较少。核不育系（Genic male sterility，GMS），棉花的核不育遗传较为简单，一般受一对或者两对基因控制，因而在生产中使用较广。多年的研究表明，利用隐性核不育系生产杂交种具有许多优点：可充分利用新育成的常规品种（陆地棉或海岛棉）作恢复系，配制新的杂交组合，在较短期内将高产、优质、 早熟、 抗性等性状综合为一体；核不育系通过杂交，较易转育成各种农艺性状类型的不育系等。生态敏感型不育（Environment sensitive male sterility，EMS），由于外在环境如光、温度等环境因子的刺激使得植物雄蕊败育不能产生正常花粉（或花药）的类型[7]~[8]。
2. 研究的基本内容和问题
陆地棉雄性核不育在杂种优势的利用中具有至关重要的作用。棉花雄性核不育主要受主效隐形或者显性基因控制，隐性核不育几乎可以被所有常规品系品种所恢复，因而在生产上大放光彩，逐渐成为育种发展俄趋势。但是隐性核不育基因的研究仍然发展缓慢。国内有关定位较少，虽然胡磊（2009）对ms14进行了初定位。但该研究中作图距离较远ms14基因与标记BNL3971相距16.7cM，与标记NAU663相距更远，为单边标记，ms14基因定位仍不准确，且近十年来再无该基因相关进展，因此ms14尚未得到精确定位。本研究拟以洞A型核不育系（ms14）为母本，TM-1为父本，构建了F2群体，并对对F2中可育、不育进行了育性鉴定。采用BSA（BulkedSegregant Analysis）方法，进行SSR和Indel标记的多态性筛选和F2连锁分析，以期验证并准确定位ms14，为该基因的克隆奠定基础。
研究目标：
① 对所构建的F2群体进行鉴定，构建可育、不育池，筛选SSR引物及Indel引物。
3. 研究的方法与方案
1. 实验材料
母本：陆地棉单隐性核雄性不育系：洞A（ms14）
父本：陆地棉TM-1
SSR引物序列筛选于https://www.cottongen.org/node/49640
2. 技术路线
① 集团分离分析法（bulked segregation analysis，BSA）是对基因标记定位的特色方法之一。在一堆具有表型差异的亲本所产生的分离群体中，利用构建具有目标性状差异的近等基因池，选用合适的几类分子标记进行筛选出有差异的分子标记；再用上述筛选出的分子标记对分离群体进行单株鉴定，排除偏分离标记，从而遭到与目标基因相连锁的分子标记，进而完成目标基因的定位。包括多种分子标记技术如RELP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP、SNP、RGA等。本研究拟采用SSR分子标记技术，通过筛选特异引物，完成对每个个体进行鉴定，通过软件作图，进而获得更加准确的ms14基因定位。
② SSR微卫星的PCR扩增及PAGE银染参见张军的方法[17]，经本实验室改良后使用，具体步骤见实验方案。
3. 实验方案
3.1 作图群体的构建
（洞A×TM-1）F2群体构建
2018年以不育系洞A为母本，TM-1为父本，得到（洞A×TM-1）F1,2019年种植于XXXX，并通过自交获得（洞A×TM-1）F2。2019年9月将该F2群体进行单株育性鉴定，对当天开花的棉花进行育性调查。
3.2 棉花叶片DNA提取
采用CTAB法，手工磨样，1.5mL小提。剩余叶片保留备用。提取的DNA用1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA质量，估计数量（溴化乙锭染色的DNA肉眼刚可见的条带是10～50ng，根据条带强弱粗略定一下量）。记录。
3.3 可育、不育池的构建
2019年取F2群体中不育中挑选出五株已知育性稳定可育植株棉花幼嫩叶片进行DNA提取，混合后构成可育池，稀释存放于-20℃冰箱待用；不育池同理
3.4 SSR扩增及PAGE银染检测
3.4.1 SSR微卫星扩增及PCR扩增
SSR微卫星扩增及PCR扩增参见PAGE银染参见张军的方法[17]，经本实验室改良后使用。
（1）SSR（10微升）扩增体系：
| 10×PCR buffer | 1ul |
| 2.5mMMgCl2 | 1 ul |
| 0.2mMdNTPs | 0.2ul |
| DNA (100ng) | 1ul |
| primer R | 1ul |
| primer F | 1ul |
| ddH2O | 4.7ul |
| Taq DNA聚合酶 | 0.1ul |
（2）反应程序为：
95℃预变2min，94℃变性40s，57℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环72℃延伸7min。
（3）制胶与电泳:
① 制胶：扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度6-8%，凝胶大小180×120×1.5mm约35mL。
100mL 7.5%凝胶配方
5×TBE 20mL
30% 丙烯酰胺25 mL
过硫酸铵 1 mg
TEMED 10uL
水 加至 100 mL
② 电泳：电泳缓冲液为0.5×TBE，恒压200v，电泳1-1.5h。
（4）胶银染步骤
① 固定：将凝胶用固定液(乙醇400ml，冰醋酸100ml，加水至1000ml)浸泡至少12min。
② 银染：将凝胶转移到0.1% AgNO3溶液中银染12min。
③ 漂洗：用双蒸水洗2遍，每次30s。
④ 显色：用显色液1.5% NaOH和1%（V/V）甲醛(现用现加）显色5-8min直到看见条带清晰。
⑤ 停影：用自来水洗2次，最后泡在自来水中。
（5）试剂配方
① 5×TBE（1L的配置）：称取Tris碱54g，硼酸27.5g，于1L烧杯中，加蒸馏水溶解，再加0.5M EDTA 20ml，蒸馏水定容至lL。
② 30%聚丙烯酰胺胶（29:1）（1L配方）：
称取290g丙烯酰胺和10g甲叉丙烯酰胺于1L烧杯中，加适适量蒸馏水在磁力搅拌器上溶解后，用蒸馏水定量至1L。如果溶液杂质过多，可以过滤后使用。
3.4.2 可育池与不育池的构建
将可育池与不可育用所选取的SSR引物对其扩增，两者之间扩不出差异的，说明与育性无关，引物舍弃之；能扩出差异的引物，可能与育性有关，留作进一步试验。挑选10个左右与育性有关的SSR标记，如果不够，则重复上述步骤，直到达到十个。
3.5 小群体定位
随机挑选100个单株，将上步获得的差异标记，对每个个体进行鉴定。
将与基因池带型相同的标记记为1，无则记为0进行数据统计。将统计的数据用卡方检验判断每个标记各种基因型的分离比，排除偏分离。
3.6 运用软件进行连锁分析。
标记连锁分析采用单标记分析法，运用软件Mapmaker/EXP3.0软件作图。参考胡磊（2009）所做的遗传连锁图谱，在Chr.2上实现更为准确的棉花雄性不育基因ms14的定位
4. 可行性分析
本项目承担的实验室在2018-2019年已经完成实验材料洞A（ms14ms14）×TM-1（Ms14Ms14）的种植，构建了F2群体，并进行了单株育性鉴定，采取了叶片样品。
本实验对SSR扩增及其产物PAGE银染进行改进，具体步骤参见实验步骤。
此外，本实验室拥有进行分子生物学研究的相关仪器设备，如PCR仪、电泳设备、低温离心机、超净台、恒温仪、分光光度计、光照培养箱、生化培养箱等先进设施。实验室依托作物遗传与种质创新国家重点实验室，实验室公共平台拥有的体视显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、定量PCR仪等可供本项目研究使用。所有实验条件完全满足本项目的所有需求，确保项目的顺利进行。
4. 研究创新点
我国棉花生产大国也是棉花消费大国，棉花是关系国民经济和人民生活重要战略物资。杂交优势利用是提高棉花产量、品质和抗性的重要途径。棉花核雄性不育发展潜力大，然而近几年国内关于棉花核雄性不育基因定位相关报道较少。洞A是由ms14单基因控制的隐性核不育系，前人已经将该基因定位于第二条染色体上，但是距离最近的分子标记大于16cM，因此，本研究拟进一步精确定位，以便对该基因进行克隆和应用于杂种棉育种。
5. 研究计划与进展
2018-2019年完成实验材料洞A（ms14ms14）×TM-1（Ms14Ms14）的种植，构建了F2群体，并进行了单株育性鉴定，采取了叶片样品。及可育池、不育池的构建；
2020年1月-2020年2月 完成SSR引物筛选；
2020年3月2020年-4月 小群体定位，对每个个体进行鉴定。将统计的数据用卡方检验判断每个标记各种基因型的分离比，排除偏分离；
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