1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、研究意义
生防假单胞菌（Pseudomonasspp.）是植物根围促生细菌（Plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR）研究领域的重要组成部分。这类细菌能高效利用植物根系的分泌物，快速地生长繁殖，从而有效定殖在植物根际或体内，并可通过产生多类抑菌和促生活性物质，起到防治植物病害的作用。部分菌株对植物病害具有较好的防治效果，如国外的Pf-5和CHA0等，国内的M18和2P24等。这类高效生防菌株通常具备一些共性特征，如定殖能力强和能产生大量的抑菌活性物质等。其中，成功定殖是其发挥生防活性的第一步，决定其能否与植物建立“互作共赢”的关键。研究这类菌的活性物质调控机理和定殖规律，能为提高活性物质的产量和菌株的环境竞争能力，提供理论依据。
2. 研究的基本内容和问题
四、研究目标研究表明，生防菌株群集运动在其定殖活动中发挥着重要作用。本课题前期分析发现，生防假单胞菌P. protegens Pf-5菌株能够产生一种活性物质——脂肽化合物orfamideA，Orfamide A能够抑制真菌的活性，同时具有表面活性剂的功能，对Pf-5的群集运动起着重要作用。生物学分析发现在orfamideA合成的调控基因ofa的下游存在一个转录调控因子LuxR2150，猜测其可能调控该脂肽化合物的合成。本课题旨在研究转录调控因子LuxR2150对orfamideA合成是否存在调控作用，以及其调控机理。
五、研究内容
3. 研究的方法与方案
七、研究方法
1. 三亲交配法
（1）接种受体菌在KB培养基中，28℃培养，等单菌落长出来后，挑取单菌落接种到KB液体培养基中，28℃摇床震荡过夜。
（2）接种帮助菌在固体LB培养基上，37℃培养，等单菌落长出来后，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡过夜。
（3）接种供体菌在固体LB培养基上，37℃培养，等单菌落长出来后，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡过夜。
（4）测量OD值，当三种菌生长到OD260为0.5左右时，各取3mL菌液混匀。将无菌滤纸平铺在KB固体培养基上，取50μl混合菌液涂布于0.22um水系细菌滤膜，28℃过夜培养。
（5）用灭菌的牙签将长出菌落的滤膜转接到含有Amp抗性和Kn抗性的KB液体培养基上，28℃过夜培养。
（6）用接菌环蘸取菌液在含有Amp抗性和Kn抗性的KB固体培养基上划线，28℃培养箱培养1天，直至长出菌落,并挑取单克隆。
2. PCR扩增反应
设计正确的引物，然后加入相关试剂进行PCR扩增。
PCR反应体系如下（所有操作于冰上进行，各组分解冻后充分混匀，用完之后及时放回-20℃冰箱保存）：
表1 PCR反应体系
| 试剂Reagents | 用量Quantities(μl) |
| ddH2O | Up to 50μl |
| 2xPhanta MaxBuffer | 25μl |
| dNTP Mix | 1μl |
| 上游引物 | 2μl |
| 下游引物 | 2μl |
| Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase | 1μl |
| 模板DNA | Xμl |
不同模板最佳反应物浓度有所不同，下面为50μlPCR体系推荐模板使用量：
表2 50μlPCR体系推荐模板使用量
| 模板种类 | 模板起始量 |
| 基因组DNA | 50-400ng |
| 质粒或病毒DNA | 10pg-30ng |
| cDNA | 1-5μl（不超过PCR反应总体积的1/10） |
PCR反应程序：
表3 PCR反应程序
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 95℃ | 3min |
|
| 变形 | 95℃ | 15s | 25-35 |
| 退火 | 56-72℃ | 15s | |
| 延伸 | 72℃ | 30-60s | |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5min |
|
注：退火阶段的反应温度根据引物的长度大小来确定。
PCR产物进行1%琼脂糖电泳常规检测。
3. T载体连接
将扩增回收得到的上下游片段用TA克隆的方法与T载体进行连接。
表4 T连接体系
| 试剂Reagents | 用量Quantities(μl) |
| DNA片段 | 1.0 μl |
| pMD18-T | 1.0 μl |
| Solution I | 5.0 μl |
| Steriledistilled water | Up to 25 μl |
将上述试剂加入到1.5ml离心管中，然后连接体系放置16℃金属浴中，反应过夜。
4. 大肠杆菌TOP10的转化
（1） 将大肠杆菌感受态从-70℃取出，并放置在冰上解冻 5 min；
（2） 向100 μl感受态中加入10μl待转化片段，用移液器轻轻吸打混匀后，冰上放置 30 min；
（3） 将大肠杆菌感受态在 42℃水浴锅中热激 90s 后迅速将感受态放于冰上 2 min；
（4） 向感受态中加入 900μl LB，放置在 37℃ 摇床中 150 rpm 培养 1 h 左右；
（5） 将培养好的菌液 5000 rpm 离心 2min，弃掉 400μl 上清，将保留的菌液吸打混匀后，取 100μl 菌液用涂布棒（涂布棒需经过酒精灯灼烧灭菌并且冷却后使用）均匀涂在含有相应抗生素的平板上，轻轻推直到感到干涩即可，放置在37℃培养箱中培养 12-16 h；
（6） 挑取平板上的转化子，用含有相应抗生素的液体 LB 培养基液摇培养，等到长出单菌落以后，再进行质粒提取。
5. 酶切反应
将所提取的质粒利用Hind III 和 Sal I进行酶切。酶切反应体系见下表：(20 μl体系)
表5 酶切反应（20 μl）体系
| 试剂Reagents | 用量Quantities(μl) |
| 片段 | 1000/x |
| Hind III | 1 |
| Sal I | 1 |
| 10×Buffer | 2 |
| ddH2O 定容至 | 20 |
6. T4连接
将酶切好的融合片段及质粒进行连接。
连接体系如下：
表6 T4连接体系
| 试剂Reagents | 用量Quantities(μl) |
| 片段 | 3 |
| pK18mobsacB（HindIII 和 Sal I） | 2 |
| T4 ligase | 1 |
| T4 Buffer | 2.5 |
| ddH2O 定容至 | 25 |
连接反应条件：16℃过夜连接。
7. 结晶紫染色方法观测生物膜
以KB液体培养基中培养待测菌株至对数生长期，取2ml菌液加入试管摇床培养48h后，加入100μl0.1%的结晶紫溶液，染色20min，移出染色后的混合物，以蒸馏水冲洗试管，800μl无水乙醇洗脱结晶紫，分光光度计检测OD600数值。
8. 群集运动检测
划线接种活化菌株于KB培养基平板，挑取单菌落转接到KB液体培养基中，过夜培养，转接至新的KB液体的锥形瓶中，28℃,200r每分钟震荡培养3h左右，震荡培养到OD600=1.0左右。准备0.7%琼脂KB培养基固体平板（平板直径9cm），每板倒入25mlLB培养基，敞口吹风冷却后备用。在平板正中央点10μl菌液，吹干，28℃培养，每隔2h观察一次，记录菌落扩展直径，直至菌落扩展满全板。
9. 抑菌作用检测
培养一定量的菠萝泛菌作为实验菌种，然后将实验菌种的培养液按照一定的比例（1％）加入到冷却到50℃左右的LB培养基中（配制方法见上）中混匀，制成含菌平板，在距离中心2.5 cm处十字垂直放置4个直径为4 mm的灭菌滤纸片，吸取相应的脂肽化合物10 μl，接种于灭过菌的滤纸片上，置于28℃培养箱共培养2~3 d，观察并记录平板对峙实验中抑菌圈的直径大小情况。
八、技术路线
九、实验方案
1. Pf-5菌株LuxR2150基因突变体的构建。
先设计引物扩出PFL2150基因的左右臂，再与T载体融合，然后将重组质粒导入大肠杆菌中大量繁殖；提取质粒，酶切，将PFL2150左右臂的融合片段克隆到pK18mobSacB载体上，获得重组质粒，通过三亲交配的方式导入野生型菌株中，然后涂布在含有Amp和Kn抗生素的KB培养基上进行交换子的筛选，一次同源交换后能获得同时具有Amp和Kn抗性的单交换子。验证正确的单交换子再接种于不含抗生素的KB培养液中生长12个小时，然后涂布于含10％蔗糖的KB培养基上进行生长，由于载体上sacB基因在含有蔗糖的培养基上具有自杀的能力，可以促进同源臂片段与目的基因之间发生第二次同源重组，形成双交换子。随即挑取单菌落分别于KB Amp和KB Kn平板上生长，不能在这两种平板上同时生长的菌落就是发生第二次同源重组的双交换子，最后设计外围引物进行PCR扩增验证，筛选出目的基因被敲除的转化子，即Pf-5ΔPFL2150。
2. Pf-5菌株LuxR2150基因回补体的构建。
PCR扩增PFL2150基因，用TA克隆的方法与T载体进行连接，送到测序公司测序正确后，将样品取回，进行大肠杆菌的转化，转化成功后，提取质粒，检测浓度，根据所测质粒浓度，利用酶切，连接到回补载体pVSP61 上，通过三亲交配，将其回补到LuxR突变体中。
3. Pf-5菌株LuxR2150基因突变体、回补体、野生型的生物膜表型检测。
结晶紫染色方法观测生物膜：
以KB液体培养基中培养待测菌株至对数生长期，取2ml菌液加入试管摇床培养48h后，加入100μl0.1%的结晶紫溶液，染色20min，移出染色后的混合物，以蒸馏水冲洗试管，800μl无水乙醇洗脱结晶紫，分光光度计检测OD600数值。
4.Pf-5菌株LuxR2150基因突变体、回补体、野生型的群集运动表型检测。
划线接种活化菌株于KB培养基平板，挑取单菌落转接到KB液体培养基中，过夜培养，转接至新的KB液体的锥形瓶中，28℃,200r每分钟震荡培养3h左右，震荡培养到OD600=1.0左右。准备0.7%琼脂KB培养基固体平板（平板直径9cm），每板倒入25mlLB培养基，敞口吹风冷却后备用。在平板正中央点10μl菌液，吹干，28℃培养，每隔2h观察一次，记录菌落扩展直径，直至菌落扩展满全板。
5.Pf-5菌株LuxR2150基因突变体、回补体、野生型的抑菌作用检测。
培养一定量的菠萝泛菌作为实验菌种，然后将实验菌种的培养液按照一定的比例（1％）加入到冷却到50℃左右的LB培养基中（配制方法见上）中混匀，制成含菌平板，在距离中心2.5 cm处十字垂直放置4个直径为4 mm的灭菌滤纸片，吸取相应的脂肽化合物10 μl，接种于灭过菌的滤纸片上，置于28℃培养箱共培养2~3 d，观察并记录平板对峙实验中抑菌圈的直径大小情况。
十、可行性分析
1. 充分的立项依据：申请者所在的生防与细菌分子生物学实验室，在植物病原细菌的致病机理和生防菌抗病机理等方面有丰富的研究积累，同时也形成了对生防假单胞菌防治植物病害反应机理研究的完整研究思路。
2. 成熟的研究体系：本实验室建立了成熟的生防与细菌分子生物学研究技术，还有相应的分子生物学技术平台，掌握完成本项目所需的全部关键技术。
综上所述，对于本项目，我们研究方向新颖，制定的研究实验方案切实可行，研究团队工作基础扎实，涉及的实验技术成熟，依托的实验室装备合理管理水平高，所有这一切能保证本项目的顺利实施。
4. 研究创新点
十一、特色或创新之处
生防假单胞菌在防治植物病害反应方面具有重要的调控作用，而生防假单胞菌P. protegens Pf-5菌株的脂肽化合物orfamide A，不仅具有抑制真菌的活性，并具有表面活性剂的功能，影响菌株群集运动。解析脂肽化合物orfamide A合成的转录调控因子的功能及作用机制对生防菌的应用与推广具有重要的意义。而LuxR2150基因是否参与调控脂肽化合物orfamideA的合成过程还不清楚。本研究着重探讨转录调控因子LuxR2150能否调控OrfamideA的合成，以及影响菌株的重要生防性状如群集运动、生物膜和抑菌作用等。研究这类菌的活性物质调控机理和定殖规律，能为提高活性物质的产量和菌株的环境竞争能力，提供理论依据。为生防菌生防机理的研究提供新思路和新途径，另外在生防菌的推广与应用提供理论支撑。
5. 研究计划与进展
十二、研究计划及预期进展
2019年9月-2020年1月
（1）Pf-5菌株LuxR2150基因突变体的构建。
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